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ありがとうございます！ 削除/引用 No.547-13 - 2009/05/26 (火) 13:16:55 - アラビ 皆様ありがとうございます。 お一人お一人にコメントをお返しできず、また現状の情報が不十分で申し訳ありません。 けいさんのおっしゃられているように、セルフライゲーションによるものと思しきバンドがあります。 ~さんにご指摘頂いた条件を検討するためにも、目下コントロールをネガティブとポジティブ両方で行い、試薬やコンピなどの精度、インサートなし条件でのコロニー出現率、ごみの有無などを確認してみようと思います。 また、教えていただいたような一度精製を行っての制限酵素処理なども視野に入れ、実験を進めていこうと思います。

(無題) 削除/引用 No.547-10 - 2009/05/26 (火) 12:08:56 - ~ >けい さん 市販のTベクターでそれほどセルフライゲーションは出てこないと思いますが。 質問者さんが持ち込んだDNA量やコロニー数の情報を出していないので、実はセルフライゲーションなのかもしれませんが。 １．本当にセルフライゲーション 頻度によってはメーカーに文句を言う。 ベクターを変える。 ２．ごみ(目的以外の配列)が入っている ごみをライゲーションに持ち込まないようにする。 サイズや配列によって、切り出し、制限酵素後に切り出しなど除き方は変わるでしょう。 ３．実はちゃんと入っていて、コロニーPCRが失敗しているだけ コロニーPCRの条件を調整する。（基本的には薄める方向？） ミニプレップなどで確認する。(ちゃんと入っていれば4〜8コロニーで十分でしょう) など、状況によって改善する方向は異なるでしょう。 今のところ質問者さんからの情報は、 >目的のインサートは見られませんでした。 だけですので、１〜３のどれがあてはまってもおかしくありません。 トラブルが起こりやすい点の指摘は後々にここを見る人には役に立つでしょうけれども、 質問者さんの問題解決には、質問者さんの現状の把握が一番の近道だと思います。

(無題) 削除/引用 No.547-9 - 2009/05/26 (火) 04:15:30 - おお >[Re:1] アラビさんは書きました : > 　どうして白色コロニーなのにインサートされていないのでしょうか？ フレームがあってないか、活性を阻害できるほどの長さのインサートが 入っているばあい、白になります。 たとえばインサートなしライゲーションでどのくらい白になって、何個 コロニーが生えるでしょうか? これがインサートありと同様であればライゲーションがうまくいってないですね。インサートしようとするDNAが悪いのでしょうか?それともライゲーション自身がうまくいってないのでしょうか? もし、インサートなしのライゲーションよりコロニーが多く取れるなら ライゲーションはうまくいっているけど目的のインサートが入っていない。 では何が入ったのでしょうか?これはすでに対処法などが指摘されてます。

(無題) 削除/引用 No.547-8 - 2009/05/25 (月) 22:54:37 - けい >>~さん TAクローニングで目的以外の断片が見られたということはセルフライゲーションしたということではないでしょうか？ 私もセルフライゲーションによるものと見られるバンドが出現したことがあります。 ベクターの量とインサートDNAの量を検討してみてはどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.547-7 - 2009/05/25 (月) 20:31:06 - ~ >目的のインサートは見られませんでした。 では何が見られたのですか？ 見られたものによって、対応策は変わってくるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.547-6 - 2009/05/25 (月) 17:58:11 - ザンギ スピンカラムでPCR反応物を精製するだけでも当選確率が随分上がりますょ。 その他、膨大な指摘と議論がありますので、ぜひとも過去ログをご覧ください。 トップページからGoogleのサイト内検索ができます。

(無題) 削除/引用 No.547-5 - 2009/05/25 (月) 17:47:38 - とおりがかり 私もインサートをゲルから切り出して精製するだけで問題解決ではないかと思います。 急いでいる時には面倒に感じてしまうのですが、 はじめから精製しておけば時間の節約になったのに、ということを TAクローニングでもTOPOクローニングでも、私自身はしばしば経験しています。

(無題) 削除/引用 No.547-4 - 2009/05/25 (月) 16:40:47 - こうじ コロニーPCRは増えなくても当たりがあるかも？ぐらいで 使うのがちょうど良い方法だと私自身は感じています。 手間ですが一度精製されてからpCR系ベクターならEcoRIなどで切ってみると良いと思います。 InvitrogenのpCRで一度ハマったことがあります 形質転換効率がかなり悪く、 強引に白コロニーつついてシークエンスしても空ベクターで、、、 クレーム出して別ロット出してもらったら 一発でうまく行きました。

(無題) 削除/引用 No.547-3 - 2009/05/25 (月) 16:20:30 - DNAI コロニーPCRは菌体の入れすぎでworkしなくなります。 だめもとでコロニー数個をミニプレしてみてはいかがですか。 以外に入っていることが多いですよ。

(無題) 削除/引用 No.547-2 - 2009/05/25 (月) 15:37:53 - やま コロニーＰＣＲに青コロニーも何個か入れると良いですよ。 ちょっとした小さい物が入ったりしてフレームがずれてできた白コロニーや 偶々フレームが一致してインサートが入っているのに青コロニーなど 色々な物ができるので青白判定は信用していない人が多いと思います。 目安にはなりますけど。

TAクローニングでDNAが入りません 削除/引用 No.547-1 - 2009/05/25 (月) 15:25:31 - アラビ 　Invitrogenのキットを用いてTAクローニングを行いました。導入したい遺伝子をPCRで増やし、プラスミドとライゲーションさせ、コンピテントセルに導入し、抗生物質とx-galを加えたLBプレートに撒きました。 　翌日、プレートに出現した青色・白色のコロニーのうち、白色のコロニーを用いてコロニーPCRを行い、電気泳動でバンドの確認を行いました。その結果、目的のインサートは見られませんでした。コロニーPCRの際のプライマーはベクター側を用いています。 　どうして白色コロニーなのにインサートされていないのでしょうか？ライゲーションさせる前に導入したい遺伝子が増えているかどうかは電気泳動で確認済みです。

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