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(無題) 削除/引用 No.529-5 - 2009/05/28 (木) 08:40:29 - ねぎ おお様 返信が遅くなってしまい、申し訳ございません。また、いろいろとご助言ありがとうございます。 あれから数日経ちましたが、bait+候補AD plasmidの形質転換体コロニーが遅れて生えてきました。これはこれでいいのですが、今回のre-testようにネガコン（空bait plasmid+候補AD-plasmid）の方が先に生えてくるなんてことがあるのでしょうか（生えて欲しくなかったのですが）。ちなみに、各bait+候補AD plasmidの形質転換体コロニーの出現日数は、ほぼスクリーニングでの出現日数を再現しているようです。QDO（-Trp-Leu-His-Ade)に塗りなおしてみればわかるのでしょうが、これらはやはりfalse positiveなんでしょうかね。 コロニーリフトもやってみたいのですが、当方にレプリカ作製用の道具がありません。今度自作しようかな。

(無題) 削除/引用 No.529-4 - 2009/05/24 (日) 03:54:53 - おお >[Re:3] ねぎさんは書きました : > おお様 > 早速の御助言ありがとうございます。スクリーニング前のbaitチェックで-His培地上ではバックが出ないということを確認していますので、3-ATは添加せずにやっています。 そうですか、バックが出ないのは珍しい方だと思いましたが、 そういうこともあるのかもしれませんね。 > 先日、SD/-Trp-Leu-His-Ade培地でre-testをやったのですが、何にも生えませんでした。このフォーラムでも言及されていたようですが、栄養選択で耐性を発揮するには相当時間がかかるらしく、そのため選択のハードルが高いとinteraction positive cloneでも生えにくくなるとのことです。 SD/-Trp-Leu-Hisの時もそうだと思いますが、スクリーニングであれば1週間とか待ちます。1ー2週間の間でコロニーをピックアップする感じです。ですから、イーストが遺伝子を獲得してすぐの状態(トランスフォーメーション直後とか、メイティング直後)に選択バイチにまく場合それなりの時間がかかります。 > これが原因かなと思い、SD/-Tro-Leu-Hisからやっているのですが、 SD/-Trp-Leuでまずコロニーをえてから、選択バイチなどにまくのがいいかと思います。この場合1週間も必要ないのがたいていです。3日ぐらいでだいたいケリがつくのではないでしょうか(特別な場合をのぞいてですが)。 得られたコロニーをSD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His、SD/-Trp-Leu-His-Adeそれぞれにレプリカをとるようにまき、テストするとデーターにしやすいと思います。好みかもしれませんがLacZのテストはSD/-Trp-Leu からコロニーリフトして検出していました。ネガティブのクローンが コロニーが存在しLacZ活性がないという事が示せるので ネガティブコントロールをおけるというのが利点です。 >妙な結果になっています。3-ATを加えないせいでしょうか。b-galについては、次にSD/-Trp-Leu-His-Ade培地でやる予定でしたので、その時に添加しようと思っていました。 あなたのその実験系でバックグランドと判断するなら3ーATを加えても いいのではないでしょうか。もともと非常にバックグラントが低い とお考えなら1mMくらいで十分かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.529-3 - 2009/05/23 (土) 15:41:42 - ねぎ おお様 > SD/-Trp-Leu-Hisの代わりにSD/-Trp-Leu-His-Adeを使ってみてはどうでしょうか? > Hisは比較的リーキーなので3-ATをバックグランドが出ない最低限量 > 加えてあっせいする事がおおいです。3-atの量はそれぞれのシステム > (ベイトやプレイ、ベクターの強さなど)によって変わります。 > SD/-Trp-Leuでb-galのあっせいというのも選択肢だとおもいます。 > 早速の御助言ありがとうございます。スクリーニング前のbaitチェックで-His培地上ではバックが出ないということを確認していますので、3-ATは添加せずにやっています。先日、SD/-Trp-Leu-His-Ade培地でre-testをやったのですが、何にも生えませんでした。このフォーラムでも言及されていたようですが、栄養選択で耐性を発揮するには相当時間がかかるらしく、そのため選択のハードルが高いとinteraction positive cloneでも生えにくくなるとのことです。これが原因かなと思い、SD/-Tro-Leu-Hisからやっているのですが、妙な結果になっています。3-ATを加えないせいでしょうか。b-galについては、次にSD/-Trp-Leu-His-Ade培地でやる予定でしたので、その時に添加しようと思っていました。

(無題) 削除/引用 No.529-2 - 2009/05/23 (土) 05:16:46 - おお SD/-Trp-Leu-Hisの代わりにSD/-Trp-Leu-His-Adeを使ってみてはどうでしょうか? Hisは比較的リーキーなので3-ATをバックグランドが出ない最低限量 加えてあっせいする事がおおいです。3-atの量はそれぞれのシステム (ベイトやプレイ、ベクターの強さなど)によって変わります。 SD/-Trp-Leuでb-galのあっせいというのも選択肢だとおもいます。

Y2H陽性クローンのRe-testについて 削除/引用 No.529-1 - 2009/05/22 (金) 18:40:03 - ねぎ いつも参考にさせていただいております。 私はAH109でY2Hを試みていまして、最近、採れてきたHis+/Ade+クローン由来のADプラスミドが本当にbaitと相互作用するのかについて検討を行っています。 クロンテックのマニュアルに従い、ネガコンとして空pGBKT7と候補遺伝子を含むプラスミドで形質転換を行ったものを加えています。 現在、SD/-Trp-Leu-Hisプレートに播種して3日目なのですが、上記ネガコンでコロニーが出てきました。普通に解釈すれば、このADプラスミドクローンの産物はDNA-BDと相互作用していたものだと考えられますが、問題はpGBKT7/baitと候補ADプラスミドの形質転換体のコロニーが出現していないことです。偽陽性クローンだとしても、pGBKT7/baitと候補ADプラスミドの組み合わせでもコロニーがでなければならないと思いますが、これはただ単にコロニー形成が遅いだけなのでしょうか。結果の解釈に困っています。 どなたかご存じありませんでしょうか。

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