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(無題) 削除/引用 No.517-6 - 2009/05/30 (土) 12:38:46 - 免染屋もどき 一次抗体の反応時間は室温や３７℃の場合では３０分で染色されているのに６０分で染色されていないというのは経験した事がありませんね。 ＣＪさんのおっしゃる通り４℃　オーバーナイトが一番綺麗に染まる事が多いです。 免染がうまくいかない時はむしろ脱パラが不十分とか賦活化が上手くいっていないとか他の要因のほうが考えられると思います。もちろん賦活化や内因性ペルオキシダーゼ処理の後の洗浄も大事だと思います。 まれにですが薄切してから時間を置くと染色されなくなるものもあります。その時は新たに切りなおす必要があります。 ＭＷ処理は専用機か電子レンジなのか。熱処理にはＭＷ、オートクレーブ、圧力釜などを使用しますが、電子レンジを使用したＭＷ処理の場合、染色バットを置く位置によっては染色むらがおこる場合があります。 抗体の賦活化も抗体によってはクエン酸より高ｐＨの緩衝液や蛋白分解酵素処理の方が適している場合もあります。市販の多くの抗体は取り扱い説明書に記載されてますし、その指示に従った方が上手くいきます。 必ず染色されるはずの陽性コントロール複数枚を使って、まずは条件を振って試されることをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.517-5 - 2009/05/21 (木) 21:22:39 - CJ そもそもその染色が「正しい分子の局在」を示しているか、って言うのが問題ですね…。組織さんに１票。 抗原賦活化後、ＰＢＳで数回洗って１次抗体をオーバーナイトでやってみてはどうでしょう？３０分とか６０分とかいうのは病理屋のせっかちなプロトコルのようです。きれいな結果のためには時間を長めで。

(無題) 削除/引用 No.517-4 - 2009/05/21 (木) 17:27:48 - 組織 あと60分と30分ならともかく、30分と40分で結果が大きく違うことはまず起こりえないでしょう。免疫組織化学ならこのくらいは誤差範囲だと思います。一次抗体の反応条件というよりも、一番の問題は結果に再現性がないことでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.517-3 - 2009/05/21 (木) 17:22:07 - 組織 一次抗体の反応時間を長くして染まらなくなるというのは、経験したことがないし、ちょっと解せない気がしますね。プロトコールをもう少し詳しく書いて頂けると、なにかしらサジェスチョンを貰えると思います。 DABで発色されているとして、一連の実験で発色時間は同じくらいにしてますか？ あと抗体の濃度や反応時間以外に、なにか変更点はありませんか？

(無題) 削除/引用 No.517-2 - 2009/05/21 (木) 16:45:15 - ~ >50倍希釈の一次抗体を反応させた（32分）ところ、うっすらと染色されました。 これの後に、同じ条件で反応させたら、同じくらいに染まるのですか？ その時点で抗体が死んで、それ以降は抗体が駄目になっているために全く染まらなくなったとも読み取れるのですが。 酵素で発色させていますよね。 酵素が失活するような条件になっていませんか？ IHCは経験がないのでよく分かりませんが、クエン酸が残っていてpHが低く、 どんどん酵素が失活したりしていませんかね。

免疫染色の反応時間 削除/引用 No.517-1 - 2009/05/21 (木) 16:15:27 - 染色 いつも勉強させていただいております。 いま、ヒト癌のパラフィン切片を用いて免疫染色をしているのですが、問題が生じ、困っています。 ご経験のある方、詳しい方がおられましたら、教えていただきたいと思いトピックを立てました。 クエン酸とマイクロウェーブて抗原賦活化を行い、50倍希釈の一次抗体を反応させた（32分）ところ、うっすらと染色されました。 もう少し濃く染まらないかなと思い、反応時間を試しに60分にしたところ、全く発色が見られなくなってしまいました。 何か手違いをしたかもしれないと思い、今度は抗体濃度を20倍希釈、反応時間を32分に戻したところ、発色が見られました。これでもまだ発色が薄かったので、20倍希釈で、反応時間を40分にしたところ、発色しませんでした。 32分で反応したときは、50倍、20倍希釈ともにきちんと期待されるところに発色がみられたのですが、反応時間を40分、60分と長くすると、発色がなくなってしまいます。 抗体、抗原によっては、短く反応したほうが染色性が良いということはあるのでしょうか？ 素人考えで、濃度を濃くすれば濃く染まる。反応時間を長くすれば濃く染まると思っていたので、どこがいけなかったかと悩んでおります。 わかりづらい文章で申し訳ありません。 どなたか詳しい方がいらっしゃいましたら教えてください。

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