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(無題) 削除/引用 No.515-10 - 2009/05/22 (金) 21:05:44 - スノ ~さん 限外濾過が簡易にできるのですね、知りませんでした。 選択肢がまた一つ増えました。 また、リファレンスまでつけて頂けるとは思っても いませんでした。 早速、請求して読んでみます。 CJさん うちの研究室でも、これまでは、CJさんやおおさん が仰るように超純水で調製した人工脳脊髄液をフィルターで 濾過して用いていました。 しかし、上の人に「パイロジェンの影響は考えているのか？」 と突如言われ、調べているうちによく分からなくなって、 ここで質問をさせてもらっているという状態です。 そのような中、 >生理屋はフィルターで済ましていますね という一般的なお言葉を頂けるのは、有り難いです。

名前だけでは1種類の組成に定まらないようですが。 削除/引用 No.515-9 - 2009/05/22 (金) 00:05:36 - ~ (WO/2006/115057) ARTIFICIAL CEREBROSPINAL FLUID ナトリウムイオン 120〜160mEq/L、カリウムイオン 1〜6mEq/L、塩素イオン 75〜155mEq/L及び重炭酸イオン 5〜45mEq /Lを含有する人工髄液、及び、更に、10g/L以下の還元糖、５mmol/L以下のリン酸、5mEq/L以下のカルシウムイオン及び5mEq/L以下のマグネシウムイオンから選ばれた少なくとも一種の成分を含む人工髄液を提供するものである。 Table 1. Components of artificial cerebrospinal fluid. In mMIn g l-1 Part 1 NaCl 1247.25 KCl 2.50.26 MgSO4filled circle7H2O1.50.37 NaH2PO4 1.250.17 CaCl2filled circle2H2O2.50.29 Part 2 Glucose 101.80 NaHCO3 252.10 J Martin Verkuyl and Andrew Matus Nature Protocols 1, 2399 - 2405 (2006) などでしょうか？ 高分子を含まないというのが同じであれば、 限外ろ過でLPSは除けるという部分は変わらないと思います。

(無題) 削除/引用 No.515-8 - 2009/05/21 (木) 21:25:28 - CJ 人工脳脊髄液ですね。あまりオートクレーブするとは聞いたことがありません。多くの生理屋はフィルターで済ましていますね。

何か分かれば考えようが出てきます。 削除/引用 No.515-7 - 2009/05/21 (木) 20:19:57 - ~ artificial colony-stimulating factor ([aCSF] 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.3 mM MgCl2, 0.1 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3, and 10 mM D-glucose, pH 7.3) のことでよろしいのでしょうか？ 高分子の成分がないので、限外ろ過で適当なMWCOでエンドトキシンをカットするのが早いと思います。 物理的に除去できます。

(無題) 削除/引用 No.515-6 - 2009/05/21 (木) 20:04:45 - スノ Pumpkinさん、おおさん、~さん 質問に抜け目や、考えが及ばない部分が数多くあり、 分かりづらくなってしまい申し訳ありませんでした。 それなのにもかかわらず、数多くのアドバイスを頂き、 有り難く思うとともに、次回質問することがあれば、 気をつけていこうと思います。 まず、aCSFのことですが、 Artificial CerebroSpinal Fluidのつもりで書いていました。 次に、エンドトキシンの測定をするための、 知識、装置、試薬は持ち合わせていないため、 ~さんが仰るように、無菌的に調整した＝エンドトキシンフリー であると乱暴な考え方をしていました。 また、具体的な目標値ですが、これについては お察しの通り、知識がない為に設定しておらず、 できることならばエンドトキシンフリーになればと 安易に考えていました。 エンドトキシンも不活化 or 除去は容易ではないので、 キリがありませんね。 今後は、エンドトキシンの具体的な目標値、 測定法などを検討した上で、既製品にするか、 無菌的調整にするかを決めていこうと思います。 多くのアドバイスを頂き、本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.515-5 - 2009/05/21 (木) 17:58:20 - Pumpkin aCSFって、artificial colony-stimulating factorですよね。おおさんのご指摘はもっともで、なんでもかんでも略語で通じると思うのは良くないです。みなさん、幅広いバックグラウンドをお持ちですので、最初の投稿時は詳しく書いていただきたいですね。 >aCSFの最終滅菌として、オートクレーブ だとすると、そもそも、こういうものをオートクレーブにかけるということ自体が間違いだと思います。

(無題) 削除/引用 No.515-4 - 2009/05/21 (木) 17:07:11 - ~ 求めるエンドトキシンのレベルは何EU/mL未満なのですか？ それが決まらないまま、ただきれいに作ろうというのはきりが無いと思います。 >これらの混入の可能性の排除ができないのは、怖いです。 と言う以上、ご自分で作ったACSFはLAL gel clot法などでエンドトキシンを測るのですか？ その手間を考えれば、規格にエンドトキシンが含まれている既製品を買っても高くは無いと思いますが。 きれいに作ったからエンドトキシンがどれだけ含まれるのかは調べなくても実験に使える、と考えるのは乱暴だと思います。 エンドトキシン除去カラムなどは市販されています。 原料や調整工程に由来するエンドトキシンを除きたいのでしたら、 そちらを使うのもいいでしょう。 （それもエンドトキシンの測定が前提になると思いますが）

(無題) 削除/引用 No.515-3 - 2009/05/21 (木) 15:36:37 - おお aCSFってなんでしょうか? もしかしてACSF (Artificial CerebroSpinal Fluid) これのことでしょうか? これなら水に溶かしてフィルターで良いと思いますが、、、 エンドトキシンについてはカルチャーグレイドのものなど 純度の高いものをつかい、器具はなるべくディスポで調整するか、 アルカリ洗剤でよく洗ったものをつかい、 水もミリQから直接取ったものを使ったり工夫して、0.2umでフィルター すればいいかと思います。 エンドトキシンを除くためにオートクレーブってあまり意味がないと 思います。 燐酸バッファー中にCa Mgをくわえてオートクレーブすると沈殿 する事があります。 シュガーは一般的にオートクレーブしません(アミノ酸など非存在下では 比較的大丈夫なようですけど)。 最後に何らかのエンドトキシン量のチェックがいるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.515-2 - 2009/05/21 (木) 13:18:35 - Pumpkin 滅菌したい趣旨のようですが、同時にエンドトキシンフリーであることが必須であるように受け取れます。 試薬調製に用いる溶媒、器具などはエンドトキシンフリーなのですか? オートクレーブでも0.22umのフィルターでもエンドトキシンはのぞけませんよ。また、エンドトキシンを計測する系をお持ちで、これらを観察していますか? 個別に滅菌されたものを無菌的に混合メスアップすることは全く問題ないと思います。 それと、 >無菌的に調整 →無菌的に調製 です。

aCSFの無菌的調整方法 削除/引用 No.515-1 - 2009/05/21 (木) 13:04:07 - スノ aCSFを無菌的に調整するためにはどのようにすればいいですか？ うちではこれまでに、超純水で調整したaCSFの使用期限を2週間とし、 使用直前に0.22μmのフィルターで濾過して実験に 用いていました。しかし、0.22μmのフィルターでは、 エンドトキシンの除去が物理的に不可能であり、 現在、体温の測定実験を行っているため、 これらの混入の可能性の排除ができないのは、 怖いです。 そこで、aCSFの最終滅菌として、オートクレーブにかけた のですが、褐変+沈殿生成で使い物にならなくなりました。 自分なりに調べた結果、褐変はメイラード反応ではない にしてもグルコースが関与しているだろうということ、 沈殿生成は、2価の金属のCaやMgが炭酸塩やリン酸塩 として析出するということが分かりました。 しかし調整方法は、細胞培養液の調整方法はあるのですが、 aCSFはありません。その細胞培養液の調整方法は、 4液に分けて調整し、それぞれを、オートクレーブや 濾過滅菌し、それらを無菌的に混ぜ合わせ、メスアップする というものでした。 緩衝塩類溶液の調整 http://cellbank.nibio.go.jp/sheet/att00011.htm Access：2009/5/21 この調整法を参考に調整しても問題ないでしょうか？ また、他の無菌的調整方法はありますか？ できれば、既製品は使いたくないです。 アドバイスをよろしくお願いします。

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