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ヒストンアセチル化の検出（CHIPassay） トピック削除
No.51-TOPIC - 2009/02/18 (水) 17:45:44 - ひすとん
CHIP assayにてヒストンアセチル化の検討を行っております。

control群と刺激群を比較したときに、アセチルヒストン抗体のIP産物のバンドの濃さに差を認めませんでした。negative control として加えている normal IgGのIP産物ではバンドは認めませんでした。

この結果から、「control群と刺激群でヒストンアセチル化に差がない」といっていいのでしょうか？

negative controlでバンドを認めないので、抗体がdetectしているものは、アセチルヒストンだと考えてよいとおもうのですが、ただ、「差を検出するほど鋭敏なassayができてない」ということも考えられるのでは？とも思っております。

いかがでしょうか？
　
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(無題) 削除/引用
No.51-5 - 2009/02/20 (金) 15:57:07 - ひすとん
そうですよね、ポジコンとなる刺激を加えた検体を作らないといけないですよね。　ありがとうございます

(無題) 削除/引用
No.51-4 - 2009/02/19 (木) 15:49:34 - MK
TK-1さんがおっしゃられていること重複するのですが、ひすとんさんは実験系が動いているかという部分に疑問をもっているようですので、まずは実験系がきちんと動いていることを確認できるコントロールを設定する必要があると思います。

いろいろな刺激で特定の領域のヒストンのアセチル化の推移を検討している論文があると思いますので、ひすとんさんと同様の刺激でヒストンのアセチル化の推移を検討している論文のプライマーを用いたり、HDAC阻害剤であるTSA処理等をして変化が確認できるのかを確認したりするといいのではないでしょうか？

そのようなことが確認された上で目的の領域で変化が確認されないのであればその領域ではアセチル化の変化が起きていないとある程度言えると思います。

ただTK-1さんが指摘されていますように転写が活性化する時にはヒストンの修飾が変化するとともに、ヌクレオソーム自体が移動してその領域のヌクレオソームの密度がルーズになることによっても転写が活性されることも考えられます。つまりアセチル化されるヒストンの割合は増えているが、絶対的なヒストンの量が減少しているので見かけ上変化がないように見えるということもあるかもしれません。

そのような問題は修飾に関係なくヒストンをChIPできるような抗体を用いて同時に比較すれば解消することができると思います。

(無題) 削除/引用
No.51-3 - 2009/02/19 (木) 12:29:59 - ひすとん
ハウスキーピングgeneのprimerでＰＣＲすると、そこはバンドが出ます。
「positive control のprimerで差がでる」というのはどういうことでしょうか？

目的のlocusとハウスキーピングgeneのprimerでPCRをして、比較して差があるということでしょうか？

しかし、これだと異なった領域を比べているので「enrichされている」とはいえないのでは？と思うですが・・・・

わかりにくくてすみません。

http:// 削除/引用
No.51-2 - 2009/02/18 (水) 20:20:24 - TK-1
internal controlはどうなんですか？Histone acetylationの場合、house keeping geneなどのコントロールのプライマーで見て、enrichがかからないのならassayの問題ですが、自分の興味があるlocusのprimerだけで、差があるないと言っても何も言えません。ご質問のケースでは、negative controlは含まれているのでしょうが、positive controlが欠けているか、あるいはそのことについて書かれていないので、これで結論を出すのは無理でしょう。抗体が悪いのか、操作が悪くても同じ結果になるでしょう。コントロールの取れていない実験は評価するのは無理です。

仮にpositive controlのprimerできれいな差がでて、%inputで見ても妥当な値な場合で、目的のサイトのバンドに差がない場合（PCRそのものには問題がないと言う仮定ですが）、結論はほぼ出せると思いますが、一つだけ問題になる可能性はヒストンそのものの量です。genome上のあるグループのプロモーター領域はnucleosome-freeになっていて（特にCpG promoters)、その場合、その領域に存在するヒストンそのものの量がかなり低くなっています。その場合は解釈が変わってくるので、そのことも考慮してください。

ヒストンアセチル化の検出（CHIPassay） 削除/引用
No.51-1 - 2009/02/18 (水) 17:45:44 - ひすとん
CHIP assayにてヒストンアセチル化の検討を行っております。

control群と刺激群を比較したときに、アセチルヒストン抗体のIP産物のバンドの濃さに差を認めませんでした。negative control として加えている normal IgGのIP産物ではバンドは認めませんでした。

この結果から、「control群と刺激群でヒストンアセチル化に差がない」といっていいのでしょうか？

negative controlでバンドを認めないので、抗体がdetectしているものは、アセチルヒストンだと考えてよいとおもうのですが、ただ、「差を検出するほど鋭敏なassayができてない」ということも考えられるのでは？とも思っております。

いかがでしょうか？
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