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(無題) 削除/引用 No.498-6 - 2009/05/20 (水) 12:54:21 - あべちゃん レトロウイルスの話になりますが、パッケージ細胞はPBS処理しない、トリプシン処理もなるべく少なくするというのが、安定したウイルス作りに必要と言われています。 この手のパッケージ細胞を作ったギャリー･ノーランという人たちがphi-NX, phi-GPという293由来の細胞を提供しています。http://www.stanford.edu/group/nolan/ これらの細胞では、 培地を捨てる。 0.05% trypsine in HANKS buffer, 2mL/10cm incubate for 5 min トリプシン液の10倍量以上の培地で回収 といった感じで、PBSを使いません。PBSを使った処理を繰り返すと、徐々に感染力が低下します。 このことはNolan Labから細胞の分譲を委託されている施設のHPに、継代方法として書かれています。

(無題) 削除/引用 No.498-5 - 2009/05/20 (水) 11:17:40 - 通り 私は、トリプシンは使わなかったことがありません。 トリプシン自体は全く問題ないと思いますが・・・。 それよりも、一度コンフルエントになってからのサブカルチャーはダメだと思います。 このことは、すべての培養細胞で、もはや常識だと思いますが・・・。 感覚的なことで申し訳ないですが、私は付着細胞がシャーレの底をすべて覆うようになる前に （７割程度が上限かな）サブカルします。

(無題) 削除/引用 No.498-4 - 2009/05/20 (水) 10:24:37 - おお コンフルについては感覚というところもあり、なかなかそれぞれの場合 の定義がクリアーにされていません。 ただコンフルになってからサブカルチャーするのはあまりよくない ことが多いと思っています。 ほどんどの細胞が周りの細胞とコンタクトしていて、細胞の大きさが 小さくならないくらいでサブカルチャーしたほうがいいと思います。 293は(293Tも)既に悪性転換していますので、コンタクトインヒビッション がかからずどんどん密になっていってしまいます。 あとは人、実験によりそれぞれですが2-3ヶ月培養すると形態の 変化が顕著に変わってくることがおおくそれ以上培養した細胞は なるべく使わないようにすることが多いです。 最初にある程度凍結チューブを数ストックしてそこからとって 増やして実験し、2-3ヶ月培養後、細胞をすてて新たに凍結 したものから起こすぐらいにした方がいいと思います。 サブカルチャーはこの手の細胞は私はトリプシンEDTAを使っています。 PBSで洗ってから500ul/10cmのトリプシンEDTA(0.05%)をくわえ、 インキュベーターに置くと1分もせずに細胞がはがれてきそうに なるので、ディッシュを叩いてはがれるのを手伝ってから バイチにけんだくしています。この時バイチをそっとかけても はがれなかった細胞は無視しています。はがすために激しい パイペットをして細胞の調子を悪くすることがありますから。 また、1分以上はトリプシンで処理しません。 これでうまくはがれないようでしたらPBSで洗うのをやめ PBS EDTAで洗えば改善するかもしれません。 トリプシンを使わないではがす場合はPBSEDTAを使うでしょうけど それぞれのラボの細胞が同じように振る舞うか分かりませんので やってみて剥せないならパスしてもいいかと思います。

トリプシン使わない？ 削除/引用 No.498-3 - 2009/05/20 (水) 09:32:35 - かわさき ご教授助かります。 トリプシン使わないんですか？思いっきり使ってました。理研から買ったんですが、継代方法に0.25% trypsin or 0.05% trypsin + 0.53 mM EDTAと書いてありましたので、信じきっておりました・・・。 トリプシン使わないとすると、どのような継代方法になるんでしょうか？ＥＤＴＡとかでしょうか？試薬とか、濃度とか、時間とか具体的にご教授いただければ誠に助かります。どうかよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.498-2 - 2009/05/19 (火) 21:35:34 - とも 細胞はがす時にはトリプシンを使わない。 一か月に一回新しい細胞をおこす。 これをすれば安定した実験結果がえられますよ

293T細胞 削除/引用 No.498-1 - 2009/05/19 (火) 20:45:23 - かわさき いつも勉強させてもらっています。293Ｔ細胞についてお聞きしたいと思います。一応過去トピは検索いたしましたが、該当するものはありませんでした。どうかよろしくお願いします。 レンチウイルス作成のために現在293T細胞を維持しています。最近急に細胞の形がおかしくなり、また細胞増殖力も落ちているように思います。293T細胞は一度コンフルエントになってしまうとウイルス産生能が極端に落ちるとSBI社のマニュアルに書いてありました。コンフルエントになることはこれまでしばしばありましたが、あまり気にしておりませんでした。というのも293T細胞は上皮系ですが、ファイブロのような感じで敷石状とはならないためコンフルエンシーがわかりづらいためです。 恐らく現在の状況はこのマニュアルにあるような状況かと思うのですが、２９３Ｔ細胞に関して皆様はどのような点に注意して維持されておられるでしょうか？

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