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(無題) 削除/引用 No.491-16 - 2009/06/11 (木) 02:44:02 - Tb >[Re:8] みさんは書きました : > zenonより同社の共有結合させるタイプの方が良さげと思っています。 > まだ試していません。あとdojindoでも共有結合タイプ宣伝してたような。 遅レスですが、みさんの言っていたのはInvitrogen APEX Antibody Labeling Kitのことですか？恥ずかしながらこんなのがあるというのに今になって気付きました。BSAなどのstabilizing proteinが入っていてもいいとはすごいですね。どなたか試された方はいませんか？　組織さんも書いているDojindoのも混ざりものO.K.なんでしょうか？

ありがとうございます。 削除/引用 No.491-15 - 2009/05/21 (木) 13:54:07 - コーラス みなさん数多くのアドバイスありがとうございました。 いろいろと試すことはありますがすこしずつクリアしていきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.491-14 - 2009/05/20 (水) 17:55:12 - Eire メインの話題からは外れますが… >CJさん > ただ、IgMの一次抗体とかってそんな一般的なのでしょうか？ 少なくとも免疫染色に用いる一次抗体としては一般的ではないですよね。 私が使ったことのあるIgMクラス抗体も、HNK-1抗体とanti-TAG1(4D7)くらいです。

IgM antibody 削除/引用 No.491-13 - 2009/05/20 (水) 10:38:26 - real-time 二次抗体にマウスIgM抗体及びIgG抗体を用いて三色蛍光免疫染色していましたが、蛍光強度がかなり異ならない限り問題ありませんでした。ただし全てのIgGを標的としたL鎖を認識する２次抗体はIgMに結合するため使えません。IgGの各アイソタイプ特異的認識をする抗体をお使いください。一方で私の用いた抗IgM抗体はH鎖認識でしたのでので、IgGに結合する現象は見られませんでした。

Dojindo蛍光ラベルキット 削除/引用 No.491-12 - 2009/05/20 (水) 10:16:32 - 組織 下で挙げられましたが、Dojindoの蛍光標識キットは割と気に入ってます。色々な抗体に使いましたが、どれも免疫組織化学で良好なシグナルが得られています。難点は数十ugの抗体量が必要なことですね。一度スケールダウンしてトライしてみましたが、抗体量をケチるとどうも標識効率が悪いようで、うまくいきませんでした。ラボで頻繁に使うようなマーカー抗体じゃないと、使用に踏み切りづらい感はあります。 とはいえ、まずは両方の抗体できちんと染まるような固定・前処理条件を探すのが先決でしょうね。

(無題) 削除/引用 No.491-11 - 2009/05/20 (水) 06:44:14 - CJ Eireさん 間違えて抗IgGの代わりに抗IgM抗体(Vector製)を使ってしまったことがありますが、まったく染色がなかった（つまりIgGにクロスしない）ので、特異性はいいかもしれませんね。 ただ、IgMの一次抗体とかってそんな一般的なのでしょうか？使ったことがないのでわかりません。

Anti-Mouse Ig Subclass Specific Goat Antibodies 削除/引用 No.491-10 - 2009/05/20 (水) 06:25:17 - Eire 私は試したことがなく、周りに試したことがある人もいないので紹介するのも無責任かもしれませんが、参考の１つになればと思うので投稿します。 もしお使いのモノクローナル抗体について、Igサブクラス (IgG1,2a-2c,3 あるいは IgM) が同定されていて、且つ異なっていれば、サブクラス特異的二次抗体を使うことができます。Jackson ImmunoResearch が各種蛍光標識抗体を売っています。値段は高めですが。特異性がどのくらい高いのか分からないのでコントロールを取らなければいけないでしょうが、十分な特異性があれば有用なのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.491-9 - 2009/05/20 (水) 01:59:36 - in situ http://www.cosmobio.co.jp/product/raku/01440001.asp こんなのを用いて、片方の一次抗体をビオチン化するのはどうでしょう？ １．通常の一次抗体Aを反応させる ２．蛍光標識anti-mouse抗体をくっつける ３．ビオチン化一次抗体Bを反応させる ４．蛍光標識ストレプトアビジンをくっつける この手順だと、理論上クロスはしないはずですが、いかがでしょう？

(無題) 削除/引用 No.491-8 - 2009/05/20 (水) 00:54:45 - み >[Re:7] Tbさんは書きました : > 二種類のマウスモノクロでの二重染色で、Invitrogen/Molecular ProbeのZenon labeling kitを試された方はいますか？どんなもんでしょう？ mouseは無いですがrabbitはあります。 RabbitはIgGサブタイプによって上手く行かないものがあるらしい（invitrogenの人自身が言ってた）。 実際、僕の場合も全然上手く行かなかった・・・。 勿論、上手く行く人もいるだろうが、反応（protocol)自体がちょっとトリッキーかなあ。 zenonより同社の共有結合させるタイプの方が良さげと思っています。 まだ試していません。あとdojindoでも共有結合タイプ宣伝してたような。 ご参考まで。

Invitrogen Zenon Labeling kit 削除/引用 No.491-7 - 2009/05/20 (水) 00:24:24 - Tb 二種類のマウスモノクロでの二重染色で、Invitrogen/Molecular ProbeのZenon labeling kitを試された方はいますか？どんなもんでしょう？

(無題) 削除/引用 No.491-6 - 2009/05/19 (火) 22:07:01 - CJ 老婆心さんのおっしゃるとおり、理論がうまくいくとは限りませんから、コントロールは重要です。 もうひとつトリッキーな方法を紹介します。私はやったことはないですが、これで論文を書いている人もいます。 ポイントはＴＳＡ法を使うことです。ＴＳＡ法は通常の蛍光法の１０倍以上の感度があるとされています。これを使って、１次抗体を通常の蛍光法では検出できない程度まで希釈するのです。明らかにトリッキーで、クロスが起こらないための予備実験は欠かせませんが、他の動物種の抗体がどうしても見つからない場合はこの実験も考えてみてください。 １　１個目の１次抗体　通常の１０倍以上希釈 ２　ビオチン化２次抗体 ３　ＡＢＣ ４　ＴＳＡ反応 ５　（ブロックをしても良いでしょう） ６　２個目の１次抗体 ７　蛍光２次抗体 ＴＳＡキットはPerkin-Elmerなどが売っています。

(無題) 削除/引用 No.491-5 - 2009/05/19 (火) 11:49:14 - おお TRITONの代わりにジギトニンをつかうとさらにマイルドに 透過性をあげることができるかもしれません。 あとここで糖タンパクなどによく使われる固定法が紹介されていましたね。 糖タンパクといえば対象は可也のものが細胞表面とか細胞膜 に存在するタンパクがターゲットですから(今回細胞内のムチン と言う事ですけど)、膜タンパクの固定も改善されるかもしれません。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;start=1;Code=1392 PLP固定というようです。

(無題) 削除/引用 No.491-4 - 2009/05/19 (火) 11:01:03 - 老婆心 私も抗マウス抗体でのブロッキングを数回試しましたが、 理論通りの結果にはなりませんでした。 モノによると思いますが、個人的には使える他種の抗体を探す方が良いかと思います。 たまに違う目的で使いますが、ニチレイのマウスの組織を（抗体が存在する）マウスで作られた抗体で染めることが可能なキットというか、ブロッキング液があります。 それは正体不明ですが、マウスの抗体をブロックして二次抗体の抗マウス抗体の非特異をなくすものです。 質問のような目的で使用したことはありません。可能性の１つとしてお考えください。 あと、膜に穴をあけないで（無処理で）ムチンを染めたことはありませんか？ 別の細胞内のタンパク質でしたが、別に処理しなくても染まったことがあります。 処理しなくてもいいのかも、と思ったことがあります。 いつもは処理していますが・・・。 どうしても処理しなくてはならないのであるなら、 処理時間を短くしたり、濃度を薄くしたり、穏やかなサポニンとかを使ってみたり、 条件検討が必要なのかもしれません。 その辺は市販のプロトコールに詳しく書いてあると思います。

ありがとうございます。 削除/引用 No.491-3 - 2009/05/19 (火) 10:35:28 - コーラス 　ありがとうございます。さっそく試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.491-2 - 2009/05/18 (月) 22:21:52 - CJ 面倒ではありますが、単染色を２回繰り返すことで同一種１次抗体で２重染色できます。 １：１回目の免疫染色。 ２：未標識抗mouse IgGあるいは正常マウス血清でフリーの１次抗体をブロック（１時間くらい） ３：ＰＢＳで３回洗う ４：２回目の免疫染色。 ただ、染色像を確認して１回目と２回目がクロスしていないか確認するのは重要でしょう。

培養細胞の免疫二重染色について 削除/引用 No.491-1 - 2009/05/18 (月) 21:52:23 - コーラス いつも拝見させていただいております。 基本的な質問で大変恐縮なのですが培養細胞の免疫染色について教えていただけますでしょうか？ 　現在培養細胞の膜蛋白と細胞内のムチンについて免疫染色を始めました。 それぞれ単染色（マウスモノクローナル抗体）ではきれいに染めることができました。 これらを用いて二重染色を行おうと思っているのですが 　�@目的とする膜蛋白はtritonXなどの処理をせずにそのまま抗体を反応させることできれいに染まりますが膜処理をしてしまうと流れてしまうのかべったりとした染まりになってしまいます。（tritonX 0.1%で10分） 　一方で細胞内ムチンに関しては膜処理を行わないとうまく染まりません。 このような場合に二重染色をするために良い膜処理の方法などありますでしょうか？ 　�Aそれぞれマウスモノクローナル抗体では単染色において非常によくそまります。二重染色のために他の動物種のポリクローナル抗体をトライしていますが今のところ芳しくありません。過去ログではほとんどの二重染色がモノクロとポリクロの組み合わせになるということが書いてありましたがやはりマウスのモノクロ抗体を使っての二重染色は難しいのでしょうか？ 　よろしくお願いします。

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