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(無題) 削除/引用 No.488-10 - 2009/05/20 (水) 10:45:26 - ばいや そのままと推定ORFだけの２つを発現するほうがいいです。 余裕があればですが。なければ後者だけにしてます。 どちらがちゃんとした機能を持っているのかわからないし、また、作用が違えば新たな発見になるかもしれないですから。 たいていは無駄に終わることが多いような気がしますが、何事もやってみなくてはわからない。

(無題) 削除/引用 No.488-8 - 2009/05/19 (火) 09:53:32 - AP 古くKozakや他の人の調査までさかのぼると、AUGといってもinitiation codonとして働き得ない配列があります。AUGのマイナス3 ntは99%くらいプリンで、ピリミジンであることはわずかな例外です。さらにプラス1 ntも同時にピリミジンであるYNNaugYで開始される例は全く見つかっていない（か非常にまれな例外の）はずです。紛らわしい配列だと判断に困りますが、このようにあり得ない配列ならそこから飜訳される可能性を排除して良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.488-7 - 2009/05/19 (火) 05:50:01 - cDNA わかりました。 とりあえずESTクローンをトランスフェクションしてみますが、ORFを一つにする方法を準備しておきます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.488-6 - 2009/05/19 (火) 00:20:31 - おお 簡単に発現させて、チェックできるような系があればそのままつかってみて 様子をみられてみてはどうでしょうか。 そのcDNAが細胞内と同様の挙動を示すなら発現するはずです。 注意点としては、あなたがそのcDNAを得た経緯によると思いますが 次のことは考慮した方がいいかと思います。 あなたの実験(計画)でどちらのORFが重要なのかということです。 例えばほかの論文で後ろの長い法のORFだけで実験しているもの をみてそれを参照しているなら、まずそれでいいかと思います。 また、マイクロアレーで興味があるcDNAとして拾ったなら であるとするならどちらが実際に生理的に重要か分かりませんよね。 あとは、トランスレーションの位置などでスタートコドンの プレディクションか何処まで出来るか現在わたしの知識では かけませんが、そういうので裏を取ってみるのもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.488-5 - 2009/05/18 (月) 23:40:46 - Tb 私もほかのラボから譲渡してもらった発現プラスミドがそのような構造になっていたことがありました。これは数アミノ酸分の長さのものでしたが。mRNAの構造がそうなっているならまあ大丈夫だろうとおもいますし、実際問題なかったのですが、それにしても~さんが書いていますように短いペプチドも一緒に発現しているのならば実験系として厳密には問題があるのだろうなと思います。

(無題) 削除/引用 No.488-4 - 2009/05/18 (月) 16:56:03 - ~ 私ならば、いらないと考えられる上流のATGは潰すか除くかします。 (可能であれば制限酵素で) 目的のORFが発現しているかどうかは調べることが出来ますが、 その上流の部分がコードしているタンパク質が発現しないことを示すのは面倒です。 転写はされていますのでノーザンでは分かりませんし、 SDS-PAGE→CBB染色で見れるかどうかも分かりません。 (見れないからといって発現していないともいえません) みるとしたら、そのタンパク質の一部を合成して、抗体を作ってWBで見るくらいでしょうか。 (そんなことはやっていられません) そんないらないタンパク質の影響があるかどうかを考えるのは嫌ですので、ATGは潰しておきます。

(無題) 削除/引用 No.488-2 - 2009/05/18 (月) 16:45:05 - 中年 どちらが「安全」かと言えば、もちろん上流ORFを除いた方が安全でしょう。 そのcDNAが本来のmRNAの構造のとおりであって、発現の有無を確認する方法（ウェスタンなど）があるのなら、既にプラスミドもあることだし、まずはそのままトランスフェクションしてみてはいかがですか。

human cDNAプラスミドの発現 削除/引用 No.488-1 - 2009/05/18 (月) 16:28:22 - cDNA ヒトcDNAクローン(cDNA全長）の入ったESTプラスミドをトランスフェクションして発現させようと思っています。 cDNAの前にはCMVプロモーターがありますが、プロモーターとORFの間に160bpほどの短いATG-stopがあります。この場合でも目的のORFは発現してくれるものでしょうか？ ORFのみをPCRで取り出してCMV直下につないだほうが安全でしょうか？

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