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(無題) 削除/引用 No.479-6 - 2009/06/08 (月) 23:08:18 - 佐渡おけさ 私も同じような理由でCNBr活性化ゲルの代わりになる方法を探して、EDC/CH Sepharoseや、Trosyl-, Tresyl-activatedビーズ、あるいは、糖鎖を介して結合させるゲルなどもやってみましたが、どうやっても、どれひとつとして効率という点で、CNBrには遠く及ばず、結局、漏れはあきらめることとして、CNBrに戻っています。 ProteinASepharoseに架橋剤で結合させるやり方でも、漏れはありますし、CNBrに比べて特にきれいになるとか、収量が増えるということも、やった限りではありませんでした。 なぜそうなのか、理屈はよくわかりません。Tresylゲルなどの方がずっと良さそうに思えますが、不思議に思っています。ただ、漏れが気になるだけだったら、ホルマリン耐性の抗体ならば、CNBr活性化ビーズと抗体の反応後に、ホルムアルデヒドで架橋させれば良いのかもしれません。やったことないですが。

ありがとうございます！！ 削除/引用 No.479-5 - 2009/06/07 (日) 12:21:18 - ゆず 大変遅くなりましたが、いろいろとお答えいただき、 ありがとうございました。 今のカラムのまま、もう少し検討してから、それでもダメなら他のカラムの利用を考えています。 オススメのをスグ試してみたいのですが、気軽に購入できる環境にないもので・・。 そこで、再度カップリングし直してみたのですが、やはりうまく行きませんでした。 EDCは新品のものを利用し、ゲルも遠心することで、量が確認できました。 今、思いつく失敗要因としては、 �@ＥＤＣの量が多すぎる？ 理想的な終濃度が0.1Mとあったのですが、 プロトコールに載っている幾つかの例はどれも、その量よりは1/10程度（10mg/1mLゲル）といった感じです。 ですが、実際はその量よりはかなり多めなので。。多すぎると問題でしょうか？ �Aカップリング時のpHが合っていない？ 幾つかの例は、pH4.5〜6.0と様々なのですが、私が行っているものは6.0近くになっています。 （今回も、”最初の1時間はpHが下がる”ということはなかったように思います。） �B精製時の平衡化BufferのpHが合ってないのではないか？ CNBｒ-activated　sepharoseの時にちゃんと吸着したものと同一条件で行っているのですが・・。 何か少しでもヒントになるようなことありましたら、教えて下さい。宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.479-4 - 2009/05/16 (土) 13:28:20 - 名無し Protein A の担体に抗体をつけて、そのあとDMPという架橋剤で共有結合して、それからエタノールアミンで未反応のやつをブロックして、それを抗体カラムとして使えばどうでしょうか。簡単なので私はいつもそうしてます。カラム作りを朝からやれば夕方にはアッフィニティー精製まで一通り終わります。確立された方法なのでやり方の詳細はネットや実験書で探せると思います。もしmouse IgGならばふつうにやってもprotein Aにつかないので、そのときは2-3M NaCl pH8.9くらいのbufferつかえば付きます。もちろんprotein Gあればそれつかうのがいいけど。理論的には担体との結合はfcポーションのところに限られるので、抗体結合部位をロスしないので抗原の回収率もあがるのではないかとおもいます。架橋してもIgGが100%共有結合する訳でないので、一部の抗体がどうしても溶出画分に混入します。それがいやならば、あらかじめ抗体カラムをpH2.0くらいのbufferでさっと洗って未結合のものを除いてから、そのあとすぐに中性の普通のbufferで平衡化してつかうといいと思います。

(無題) 削除/引用 No.479-3 - 2009/05/15 (金) 13:51:16 - qq １）少量であれば、ゲルスラリーを入れたチューブをエッペンか１５mlチューブで遠心して量を決定します。もしくは、ディスポカラムに入れてゲル量を決定します。 ２）カップリング中ゲル懸濁液の濃度でしょ。 ３）いつ買ったかわからないECDや、日本の蒸し暑い気候を経験したECDではないですよね？ WSCやECDを使った記憶はあっても、うまく行った経験が無いので、当てにならないのですが、結局、アミド結合で繋ぐのですよね。 それなら、NHS-Activated Sepharose (Hi-trapかボトルか)をご使用になるのが宜しいかと考えます。簡単で、かなり確実です。

アフィニティーカラムの作製（カップリング方法） 削除/引用 No.479-1 - 2009/05/14 (木) 22:45:03 - ゆず ELISAの抗原に用いたい、あるタンパク質の精製を行っています。 ECH sepharoseアフィニティークロマトで行っており、ゲルにリガンド（抗体）をカップリング（縮合剤にEDC利用）させて作製しました。 しかし、実際に精製してみたのですが、泳動結果より、どうやらカップリング自体がうまくいってないようで、アプライしても、ほとんどが漏出してしまっていました。また、pHを下げて溶出させたのですが、目的タンパクは確認できませんでした。 （以前はCNBr-activated Sepharoseカラムを用いて精製していたのですが、銀染では単一バンドになったものの、ELISAに使うとなると、リガンド（抗体）が微量ですが、剥がれてきてしまってたようで、ブランクも発色しちゃいました。そこで、よりリガンドとゲルの結合力の高いECH sepharoseを試しています。精製条件は同一でやってます。） おそらく、カラム作製時のカップリング方法がうまくいってないようなのですが、操作方法にて間違っていそうな？点が幾つかありますので、誤っているところ等ありましたら、指摘していただけると嬉しいです。 �@ゲルは水（pH4.5に調製）で洗浄後、0.5M NaClで洗浄し、そのゲルとリガンド（水に溶解した後、pH4.5に調製）を2：1の割合になるようにしたいのですが、ゲル懸濁液がどうしても0.5M NaClが混ざって、容量が多くなってしまっています。ゲル懸濁液の容量はどのように測ればいいのでしょうか？そこまでゲルっぽくなってないので、ピペットで吸うと溶液（0.5M NaCl）が多く入ってしまい、ゲルだけとるのは難しいです。 �A縮合剤（カルホジイミド,EDC）は終濃度が0.1Mになるように、とプロトコールにはあるのですが、例えば、ゲル5mL分作りたいとしたら、その5mL中での終濃度ということでしょうか？ それとも、ゲル懸濁液5mLとリガンド溶液10mLをmixした15mL中での話でしょうか？ �Bカップリング反応に関して、最初の1時間はpHが下がるので、0.1M NaOHでpH4.5-6.0に調整するとあったのですが、pH試験紙で確認したところ、下がっていないようでした。�@�Aでふれましたように、ゲルの容量が多くなってしまったため、EDCを多く入れすぎたような気もします。これが原因でしょうか？ 宜しくお願い致します。

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