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(無題) 削除/引用 No.476-10 - 2010/09/30 (木) 18:01:32 - すみません さっきの投稿は間違いです。 新しいトピックで再投稿させてもらいました。

SNPのロジスティック回帰分析 削除/引用 No.476-9 - 2010/09/30 (木) 17:57:44 - 統計初心者 ケースコントロールスタディにおいて、複数の感受性遺伝子のSNPから、ロジスティック回帰分析を行っている論文を見かけますが、実際のやり方(独立変数のパラメータのとりかた)がよく分かりません。例えば、目的変数を病気の発症=1、発症しない＝0として、単独SNPを説明変数とするなら、パラメータの取り方はSNPの遺伝子型によって、AA=0,AB=1,BB=2というのな数値に変換するのでしょうか?または、AA=1,AB=2,BB=3とするのでしょうか? 複数のSNPの場合は、どういうパラメータを取ることになるのでしょうか？例えば、SNP1(AA,AB,BB)、SNP2(AA,AB,BB)、SNP3(AA,AB,BB)の場合、パラメータは組み合わせによって、1〜27の数字を当てればよいのか、説明変数を3つとして、AA=0,AB=1,BB=2とするのでしょうか? 最終的に、選択された説明変数による重回帰式（予測式）を求める具体的な方法や便利なソフトなどあったら教えて下さい。

追加 削除/引用 No.476-8 - 2009/05/22 (金) 12:18:55 - mom-a 4パラメーターロジスティック回帰が使えない場合ですが、 横軸に濃度のLog、縦軸にLogitをとれば直線になります。 これだとExcelで計算できます。 Competitive assayの場合 logit(B/Bo)=ln[B/Bo/(1-B/Bo)] Bo:Maximum binding

検量線 削除/引用 No.476-7 - 2009/05/21 (木) 10:42:15 - mom-a 私は現在は4パラメーターロジスティック回帰モデルで計算しています。 昔は96wellのプレートリーダーに解析用ソフトがついていて、その中に「ロジスティックモデル」なるものが入っていたのを使っていました。非線形回帰なので、逐次計算法が違うと計算結果が異なると思いますが、そこまで気にしていません。理論的にはこの式で良いものと考えられますし、最近使っているELISAキットはいずれも4p-logisticで検量線を引くように書いてあるので、著しく外れるようなら、測定に問題ありということだと思っています。ただ、非線形回帰の場合、計算できるソフトがあれば良いのですが、そうでないと手計算するわけにはいかないので…。（Excelでもソルバーとやらを使ってできないことはないようですが、かなり通でないと難しい気がします。） 近似する場合は、検量線の当てはまりが良い範囲が重要になると思うので、AさんのおっしゃるようなR2とか、他にlock of fit（あてはまりの悪さの検定）とかもありますが、注意が必要だと思います。また、検定結果の「数値」だけでなく、濃度が濃いほど（低いほど）検量線から外れていくなどという傾向があるかどうかをグラフ上で観察することも必要です。 > それと…、しつこいようですが、スタンダードカーブを両対数グラフでの累乗近似で作成した場合はブランクを引くのと引かないのとで値が異なるのに対して、通常グラフでの線形近似で作成した場合はブランクを引いても引かなくても値が同じなのは何故…？？？これはELISAというよりも数学の問題（？）なのかもしれませんので…恐縮なのですが。 数学の問題です。Aさんがおっしゃるとおり、普通に（実数で）直線回帰した場合は「線形」なのでブランクを引いても引かなくても直線が平行移動するだけです。累乗近似は「非線形」なのでことはそう簡単にはいかない、という感じです。超アバウトですが、この辺は数学に強い方にお聞きになった方がよろしいと思います。

(無題) 削除/引用 No.476-6 - 2009/05/20 (水) 19:15:20 - A >[Re:5] ELISA初心者さんは書きました : > Aさん、ありがとうございます。 > なるほど確かにモノクロの抗体で作成しておけば、同じ抗体をずっと使用し続けられますね。私たちはEILSAを作成して、色々な血清を測定していきたいと思っています。安定的に再現性のあるアッセイ系の樹立を目的としていますので、そういう場合はモノ・モノが一番良いかもしれませんね。 そのような話ならエピトープの異なる２つのmAbを手に入れてそれぞれ をビオチン化して検出抗体とした組み合わせで比べるといいでしょうね。 ビオチン化は結構蛋白量が必要になるでしょうからもし何年にも渡って ELISAを行うのであれば独自のmAbのクローンを得て腹水から大量に 得られると後々楽でしょう。ただ先に示したラボでの経験からすると 腹水から回収したmAbは時々バックが高い抗体になることがあるようです。 もちろん培養細胞で増やした抗体よりも雑多な蛋白質が混入してくるから でしょうけれど。 > 後半の方ですが、「ただこれは検出方法、検出範囲により異なりますから」というのはどういう場合はどうなのでしょうか？例えばスタンダードの希釈系列の倍数が小さくて、最大濃度と最低濃度の間の差があまりないようであれば対数をとる必要はないとかそういうことなのでしょうか？？「どの検量線がより確からしいか統計的に判断する」というのは何の値に対してどういう統計学的解析を適応すればよいのでしょうか？ たとえばExcelでグラフを書いて検量線を引いた時にR-squareが得られ、 全体がどれぐらい検量線に合致しているのか確認できるはずです。 何を持って確からしいと判断するかは人それぞれだとおもいますが、私の ところでは基本的にR-square>=0.95でOKにしています。1が最高の値で この0.05は統計処理の有意差でよく使われるP値のに合わせているのか なあと勝手に想像しています。更に得られた検量線の式に実際の測定値を 入れて期待値とどれぐらい離れているのか確認して(back-calculation) 検量線の範囲の内、上下10%以内に収まっている範囲のみ確からしい 範囲としています。何をしているのか文章でなかなかうまく表現できない のでうまく伝わっているといいのですが。 > それと…、しつこいようですが、スタンダードカーブを両対数グラフでの累乗近似で作成した場合はブランクを引くのと引かないのとで値が異なるのに対して、通常グラフでの線形近似で作成した場合はブランクを引いても引かなくても値が同じなのは何故…？？？これはELISAというよりも数学の問題（？）なのかもしれませんので…恐縮なのですが。 検量線が直線にのるのであればブランクの分だけ直線が上か下にシフト するだけでしょうから、問題にならないでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.476-5 - 2009/05/19 (火) 20:40:36 - ELISA初心者 Aさん、ありがとうございます。 なるほど確かにモノクロの抗体で作成しておけば、同じ抗体をずっと使用し続けられますね。私たちはEILSAを作成して、色々な血清を測定していきたいと思っています。安定的に再現性のあるアッセイ系の樹立を目的としていますので、そういう場合はモノ・モノが一番良いかもしれませんね。 後半の方ですが、「ただこれは検出方法、検出範囲により異なりますから」というのはどういう場合はどうなのでしょうか？例えばスタンダードの希釈系列の倍数が小さくて、最大濃度と最低濃度の間の差があまりないようであれば対数をとる必要はないとかそういうことなのでしょうか？？「どの検量線がより確からしいか統計的に判断する」というのは何の値に対してどういう統計学的解析を適応すればよいのでしょうか？ ブランクを引くのは基本なのですね、ありがとうございます。 それと…、しつこいようですが、スタンダードカーブを両対数グラフでの累乗近似で作成した場合はブランクを引くのと引かないのとで値が異なるのに対して、通常グラフでの線形近似で作成した場合はブランクを引いても引かなくても値が同じなのは何故…？？？これはELISAというよりも数学の問題（？）なのかもしれませんので…恐縮なのですが。

(無題) 削除/引用 No.476-4 - 2009/05/18 (月) 20:22:16 - A >（1）サンドイッチELISAで使用する抗体の組み合わせについて 私の経験ですが以前出入りしていたELISAを専門として解析していた ラボでは 固相化抗体・検出抗体＝ポリ・ポリ->モノ・ポリ->モノ・モノ の順に成熟した（安定した）ELIZAになっていきました。少なくとも そのラボではポリ・モノの組み合わせよりもモノ・ポリのほうが良い ことが多かったように思います。 ELISA初心者さんがどれぐらいELIZAを行う予定なのかわかりませんが、 当然モノクロを使えばいつでも同じ安定した抗体を使えるわけで 再現性を考えれば必然的に安定した結果が得られるはずです。 ですからもしエピトープの異なる２つのモノクロが十分量得られる のならモノ・モノの組み合わせを選ぶのが正解だと思います。 その場合、検出抗体を安定的にビオチン化して時間を節約すること もできますし（市販のアビジン化APを最終検出で使った場合）。 もし今回限りということであれば組み合わせよりも価格を気にされる のが正解かもしれません。 >（2）ELISA測定後のデータの解析方法について そのラボでは一般のキットではなくいわゆるケミルミ試薬でAPの活性を 検出していたのですがバックを引いた上で両対数グラフを使って検量線を 引いていました。ただこれは検出方法、検出範囲により異なりますから ELISA初心者さんが実際に得られたデータを解析してみるまでどちらが 正解なのか判断できないと思います。まずはELIZAのデータを得て考え られるいくつかの方法で解析してみて、どの検量線がより確からしいか 統計的に判断するしかないでしょう。どちらにしてもバックを除くのは 基本かと思います。

(無題) 削除/引用 No.476-3 - 2009/05/18 (月) 19:12:49 - ELISA初心者 Kさん、ありがとうございます。 なるほど、そのような考え方もあるのですね。 価格が安ければモノクロ、モノクロでやるとのことですが、それは値段は張るがこの組み合わせができるならそれが良いということなのでしょうか？ 2つ目の質問についてはいかがでしょうか？ 誰かご意見いただけないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.476-2 - 2009/05/15 (金) 08:43:08 - Ｋ いつもはROMってばかりですがたまには １）についてですが 私は固相にポリクロ、標識にモノクロを第一選択肢としますね。 ポリクロなら安いので、固相を10ug/mlとかの大過剰感作させて、サンプル中の抗原を全てトラップするようにする。 あとは標識側の濃度などで感度を適当に調製する。 （標識率の検定などがモノクロの方がしやすいです） 価格が安ければ（モノクロ・モノクロ）でメーカーが推奨する組み合わせでやりますが・・・

ELISAに使用する抗体について 削除/引用 No.476-1 - 2009/05/14 (木) 17:18:49 - ELISA初心者 いつも勉強させていただいています。 ELISAについて基礎的なことだと思うのですが、何点かお聞きしたくて、詳しい方がおられましたら教えていただけますでしょうか。 （1）サンドイッチELISAで使用する抗体の組み合わせについて サンドイッチELISAを作成する際のポリクローナル抗体／モノクローナル抗体の組み合わせ（固相化抗体・検出抗体＝ポリ・ポリ、ポリ・モノ、モノ・ポリ、モノ・モノ）を皆様はどのように決定されているのでしょうか？当然、とらえたい抗原、使用する抗体の能力によって左右されるでしょうから、「やってみないと分からない」というのが正しい答えというのは承知の上で質問させてください。一度に4パターンものELISAを作るのは厳しいので、どれかをまず第一選択でやってみるというような常識がもしあるのなら教えていただけますでしょうか？聞いた話ではモノ・ポリの組み合わせが多いような気がするのですが、気のせいでしょうか…。 （モノ・モノの組み合わせの際には違うエピトープを認識する抗体を使用するということは認識済みです） （2）ELISA測定後のデータの解析方法について 基本的すぎることで恐縮なのですが…。皆様は解析を行う際に、スタンダードや測定したいサンプル（私の場合は血清です）の測定値からブランク（サンプルやスタンダードの希釈の際に使用する希釈液のみを入れたもの）の測定値を引いていますか？引くようにと指導教官から言われまして、私も何となく引いた方がいいと思うのですが、少し混乱してしまいまして…。混乱の原因は以下の内容です。 ・ELISAのスタンダードカーブを皆様はどのようにして作成していますか？私たちは両対数グラフを作成し、その後スタンダードカーブを累乗近似で作成しています。このように作成した場合、スタンダード、サンプルからブランクを引いた場合と引かない場合とでサンプルの最終的な定量値が異なってきます。それに対して、両対数ではなくて通常のグラフを作成し、線形近似でスタンダードカーブを作成した場合、ブランクを引いても引かなくてもサンプルの最終的な定量値は変化しません。 という内容です…伝わったでしょうか？こうなるとELISAどうこうではなく初歩的数学の理解の問題になるのかもしれませんが、誰か教えていただけますでしょうか？

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