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(無題) 削除/引用 No.475-18 - 2009/05/18 (月) 17:00:03 - しま PFAに換えてから数mL灌流すると、マウスが伸びをするように 後肢を伸ばすのを確認されているでしょうか？（前肢も上がります） それが見られなければ、全身にPFAが回っていない可能性があります。 針先が抜けてしまっているとか、どこかの血管で詰まっているとか… 右心耳からのPFA流出が見られないということは、かなり大きな 血管が詰まっているということですので、PFAの溶け残りということは 考えにくいですけど、エアをかんでいることはあると思います。 灌流の速度も試行錯誤して最適なところを見つける必要があります。 ある程度の圧をかけないと微小血管を灌流し切れませんし、 強すぎれば逆流してしまうこともあります（肺が膨らんでしまったり）。 手動なら個人差も大きく、他人のメソッドでは失敗することがあります。

(無題) 削除/引用 No.475-17 - 2009/05/16 (土) 09:26:08 - CJ 私はマウスの場合は３方活栓を使っていますが、気泡が入らないように、まずＰＦＡの入った注射器を取り付けた後、ＰＦＡを通して全ての気泡を取り除きます。続いて生食の入った注射器を取り付けて、経路に入っているＰＦＡを洗い流します。これによって全経路から気泡が取り除けるわけです（分かりにくい？）。 ラットとか、それ以上の大きさの動物を固定する場合は経路の途中に気泡トラップを設けています。

(無題) 削除/引用 No.475-16 - 2009/05/16 (土) 08:50:30 - ねぎ 私のところでも室温で灌流固定をやっていますが、固定液の流速には非常に気を使っています。手法としては、左心室に3ミリ程度針を刺し（翼状針）血液の逆流を確認してからアロンアルファ（ゼリー状）で刺した部分を固定します。その後に生食を回し、右心房を切開すると血液がダーっと出てくるわけですが、この段階で翼状針の根っこかチューブの部分を肝臓のあたりでアロンアルファ固定します。これで針先が動くことなく安定して作業できます。次に固定液を回すわけですが、私んとこでは3方活栓は使わず（気泡が入るので）、別ビーカーに固定液をあらかじめ準備し、ポンプのチューブを差し替えることで液の切り替えをやっています。ここで一瞬ポンプのスイッチを切りますが、気泡の混入や失敗はほとんどありませんよ。　　なんか原始的な方法に見えるなぁ。

(無題) 削除/引用 No.475-15 - 2009/05/15 (金) 21:51:33 - CJ 染太郎さんのおっしゃる気泡の混入はいかにもありそうですね…。 固定温度は低温がよい、と言う人が多いのは知っていますが、例えば電顕屋の一部では低温固定は微小管の脱重合を引き起こすのでよくない、という人がいますね…。私は低温でも常温でも固定をしますが、違いを実感したことはありませんね。それよりも手早く固定することや、固定液の流速のほうが重要です。固定液の流速とin situ hybridizationのシグナルを比較したところ、見事に差が出た経験があります。

(無題) 削除/引用 No.475-14 - 2009/05/15 (金) 11:08:20 - 染太郎 三方活栓を切り替えるときに少しでも空気の泡が入っていってませんか？私の経験ではマウスの灌流の時に小さな気泡を入れてしまうとどういうわけか脳の固定，特に小脳の固定が悪くなります．血管解剖のことはわかりませんが，どこかで空気塞栓を起こしているのだろうと思います．私は翼状針を使って，生食のシリンジからPFAのシリンジに空気が間に入らないように慎重に差し替えて固定していて，うまくいっています．

固定液の温度 削除/引用 No.475-13 - 2009/05/15 (金) 08:47:51 - あっ CJさん、固定液の温度は、都市伝説的なものなんですか･････。 知りませんでした。 還流固定を最初に習った時に、よく冷やすように言われ、頑なにそれを守ってきていました。。。

(無題) 削除/引用 No.475-12 - 2009/05/15 (金) 00:42:34 - CJ 固定液や生食の温度ってのはちょっと都市伝説じみたもので（この点だけで何時間か話はできますが）、（少なくとも現時点では）気にすることではないと思います。 その他の点ではあっさんのポイントは有益だと思います。

(無題) 削除/引用 No.475-11 - 2009/05/15 (金) 00:33:48 - あっ 固定液や生食液は、37度よりも氷で冷やして行う方がよいと思います。 PFAを冷やすときに、スターラーで回しながら冷やすと粒子が濾過後に冷えるときに粒子が粗くならずに済むようです。よく冷やしてから使用前に濾過すれば、スターラーはいらないと思いますが・・・。 きちんと脱血はされているのに、PFAに切り替えたとたん流れが悪くなるのはおかしいですね。。。 針先からPFAが出ているのを、どうやって確認されているのですか？ 生食からPFAに換えるときに、針先は留置したまま動かしませんよね？ 右心耳からうまく出ているように見えないということは、どこから出ているように見えるのでしょうか？ や やはり、どこかをつきやぶっている感じがします。

(無題) 削除/引用 No.475-10 - 2009/05/14 (木) 21:37:59 - み 浮遊法も30マイクロメートルも両方やったことないですが、 脳内の血管は見れば場所は分かるので、そこを見なければ邪魔しないのでは？（見たい部分は限られた所ではないのでしょうか？） でも浮遊法なら切る前に固定しておくべきでしょうから、一番簡単なのは、やはり生食なしのPFAカンリュウor浸漬固定ですかね。 僕が考えられる範囲はここまでです・・・。

(無題) 削除/引用 No.475-9 - 2009/05/14 (木) 21:35:51 - CJ 肝臓が白くなっている、ってことは脱血ができているのでは？ ろ過は普通の濾紙で問題がないので、それが問題になることはあまりないと思います。 よくある問題で、針がうまく左心室ないし大動脈に入っていない、ということがあります。先のとがった針だとそれらの壁を傷つけやすいので、やすりなどで針先を丸くすることをお勧めします。注意深く針の先を観察していると大動脈に針先が入っているか判ります。そこまで針を進めればよい固定を得るのは難しくありません。 脱血はしたほうが美しいですが、しない場合でも（明視野免疫染色のばあい）H2O2前処理を十分行うことで赤血球の染色を防ぐことができます。なお、私の場合毛細血管が詰まって固定が悪くなるのを恐れているので必ず脱血します。 まあこの手の手技は数をこなさないことにはうまくできるようにはならないので、皆様のアドバイスを参考にされたうえでたくさん固定の練習をしてください（ねずみには悪いですが）。

(無題) 削除/引用 No.475-8 - 2009/05/14 (木) 21:35:13 - poyo 生食（PBSもしくはヘパリン添加PBS）を37℃にインキュベートしておくと良いかもしれません。 PFAは加温すると蒸気で毒性があるので、室温で構わないと思います。

(無題) 削除/引用 No.475-7 - 2009/05/14 (木) 20:56:00 - AT 皆様、早速、相談に乗って頂きありがとうございます。 おお様の言うように結晶形について考えてみます。ろ過が完全にできていなかったのかもしれません。再度ろ過してみることにします。 あっ様のおっしゃっている肝が白くなること、心臓が膨れてから右心房を切開するこについては確認できています。ご心配いただきありがとうございます。 み様、組織様、＄様にお伺いしたいのですが、最初からPFAで灌流した場合、脳切片上で残血等により像が見えづらくなったりすることはないでしょうか？現在の設備上、30umくらいの厚さまでしか切ることができません。関係ないかもしれませんが、染色は浮遊法で行っています。 宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.475-6 - 2009/05/14 (木) 19:17:31 - ＄ 私もやっていたことがあるので。 みなさんと同じ答えですが、PFAを直接流せばよいと思います。 その際、心臓には翼状針を刺して、そこへアロンアルファを一滴たらすと針先がずれなくなって非常に操作しやすいですよ。

(無題) 削除/引用 No.475-5 - 2009/05/14 (木) 17:38:57 - 組織 一度生食を通さずに直接PFAで灌流してみて、うまく灌流（あるいは固定）ができるかチェックしてみてはいかがでしょうか。脳だと前脱血処理をしなくても、血液の残留が問題になることはないと思います。

(無題) 削除/引用 No.475-4 - 2009/05/14 (木) 17:31:02 - み 生食で脱血せず、いきなりpfaを送液することは可能でしょうか？ pfaの問題、3方活栓の問題、途中で心臓を突き破り上手く入らなくなっているなど長時間送液できないテクニカルな問題。を区別できるでしょう。 蛇足ですが生の脳をOCTコンパウンドに固めて切片切ってから固定するのは駄目なのですか？

もしかして 削除/引用 No.475-3 - 2009/05/14 (木) 17:15:10 - あっ 針さきが、もしくは圧をかけすぎて心臓を突き破ってもれてるってことはないですよね？ 脱血後、肝臓は白くなりますか？ 右心耳を切るまえにほんの少し流して、心臓が膨れ右心房に戻ってくるのを確認してから切ると良いかと思うのですが、・・・・。

(無題) 削除/引用 No.475-2 - 2009/05/14 (木) 16:14:11 - おお どうでしょうか、、、PFAに微細な溶け残りの粒子とかが残っているのでしょうか、、、 直前にフィルターとか遠心してみるとか、、、空気がかんでるとかないとはおもいますが、、

灌流固定について 削除/引用 No.475-1 - 2009/05/14 (木) 15:49:17 - AT いつも参考にさせていただいております。 とても初歩的なことになりますが、皆様にアドバイスして頂けたら何よりです。 このたびマウス脳凍結切片を作製するにあたり灌流固定をしています。生食での脱血は問題なく行えるのですが、その後のPFA液での固定がうまくいかず困っています。方法はイルリガートル法で左心室に針を刺し、右心房を切って灌流しています。 固定がうまくいかないというのは、生食からPFAに三方活栓を切り替えているだけなのですが、うまく流れず固定されません。 針先からはPFAは出ているのですが、出口の右心房からうまく流れているようには見えません。 なかで血栓でも出来ているのか、なにが問題なのかわかりません。 何か考えられること、アドバイス等ありましたら御教授のほど、よろしくお願い申し上げます。

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