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参考までに。 削除/引用 No.468-4 - 2009/05/16 (土) 01:11:42 - TS 解決策になるのかどうかは、不明ですが。私の経験を情報の１つとして。 pEGFPをバックボーンとするプラスミドに変異を入れるために、QuikChange® II XL Site-Directed Mutagenesis Kitを使っていました。 付属されていたcompitent cellsは、XL-10goldで、20-30くらいのMutantをつくりましたが、問題なくできました。（もちろんpolymerase由来のエラーはときどき確認されましたが） XL-10goldは、別売りでも売ってますので、Compitent cellsを変更したら、解決するかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.468-3 - 2009/05/16 (土) 00:44:17 - pegfp おおさん 有難うございます。 ただ残念な事に単純に切って貼ってでは不可能で、新しくプライマーを購入し、PCRー制限酵素処理ーLigationとする必要が有ります。 最終的にはこの手を使うつもりですが、手持ちの材料で、ちょっとした変更でうまくいかないかなぁ、と思った次第です。

(無題) 削除/引用 No.468-2 - 2009/05/15 (金) 15:55:54 - おお 変にいじっくって最後までうまく行かないよりは、pCDNAで全部作って、 必要なものをpEGFPに移し変えてしまえばいいと思いますが、、、

pEGFPを鋳型としたpoint mutant作製 削除/引用 No.468-1 - 2009/05/14 (木) 04:03:07 - pegfp お世話になっております。 現在、ある目的遺伝子A（およそ600bp、pcDNA3とpEGFP-C1に入っています）のpoint mutantをStratageneのQuikChange II Site-Directed Mutagenesisを用いて作製しています。 予定としては5つの部位にそれぞれ単独で変異を入れたもの、つまりトータルで10個の変異プラスミドを得ようとしています。 pcDNA3-Aの5つの変異体は問題なくできたのですが、問題はpEGFP-Aで、そのうちの2つが作製出来ずにいます。cycle反応後産物をアガロース電気泳動でcheckすると、成功したものと比較してバンドパターンが少し異なり、またtransformation-miniculture後に抽出したプラスミドをinsertの両端でcutすると、サイズが600+30位のものしか取れて来ません（プライマーがタンデムに繋がった？）。現在ハズレとはわかりつつシークエンスを外注で読んでもらっています。 プロトコールは説明書に則っており�（DNAは20ng）、cycle数は12または15です。pcDNA3とpEGFP-C1で一致する変異体は同じプライマーを用いています。違いは鋳型と伸長時間（6分15秒 for pcDNA3-A、5分30秒 for pEGFP-A）です。 添付の説明書のトラブルシューティングにあるようにアニーリングの温度をいじろうかと思っているのですが、他に改善点として思い当たる点があったら教えて頂ければと思います。 また加えて質問です。 pEGFP-Aで3つ作り終えたとはいえ、実際は多少手こずりまして。 当初、キットに添付されたXL1-blueをトラフォメに用いていたのですがコロニーが得られず（pcDNA3-Aでは問題なかった）、他社のDH5aに変更する事でアタリクローンを得ました（トラフォメ前のprecultureは1hしております）。 この点を踏まえXL1-blueとpEGFPの相性？のようなものを疑っております。同様の経験をした事が有りましたら教えて下さい。 また経験的に同じような骨格（ori）をもった、しかし違う耐性遺伝子をもったプラスミドにおいて、トラフォメ効率がAmp>Kmな気がしています。それぞれの作用機序が違うからという理由だけでしょうか、なにか他に理由があるのでしょうか？（もしくはそんな事ない？） そこで、Km耐性遺伝子の乗ったプラスミドを持った大腸菌コロニーをより多く得る方法を御存知でしたら教えて下さい。 長文、乱文で申し訳ございませんが、宜しくお願い致します。

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