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ご意見感謝します。 削除/引用 No.448-8 - 2009/05/18 (月) 09:31:15 - zetton DCさん、貴重なご意見ありがとうございます。 Isotype controlもおいて測定しているのですが、このような結果になってしまうのです。 もう一度、自分の方法や手技に関して非がないか検討し、また、皆様のご意見を参考にして再度挑戦したいと思います。数々のご意見、誠にありがとうございます。また、わからない所があったら、この掲示板で質問したいと思うので、その時は力を貸して下さい。

(無題) 削除/引用 No.448-7 - 2009/05/16 (土) 15:10:36 - DC > なるほど。CD56の発現が減少したわけではなく、もともと非特異的にFcRに結合していたCD56がCD16を添加したことによって、それがBlockされたということですか。ということは、CD16を添加した後の方が正しいCD56の発現ということのなるのでしょうか。 > > 理解力が低くて申し訳ありません。もう少し力を貸して下さい。 > そうですね、この意見が本当に正しいかは申し上げにくいですが、今提示されている結果だけをみると、CD56抗体の非特異的結合がCD16抗体によって阻害されている、と考えるのが適切ではないか、という事です。 一般的に、FACSでリンパ球系を染色する場合にはFcRをブロックするか、Isotypeコントロールを置きます。FcRをブロックする場合はそのままの意味ですが、Isotypeコントロールは各IsotypeごとのFcRへの非特異的な吸着のコントロールとして用います。 これらのコントロールをとった実験を行なって、まだCD56抗体の結合が下がるようであれば、FcRへの非特異的な結合以外の要因でしょう。

返信ありがとうございます。 削除/引用 No.448-6 - 2009/05/14 (木) 08:52:24 - zetton DCさん、経験者さん返信ありがとうございます。 なるほど。CD56の発現が減少したわけではなく、もともと非特異的にFcRに結合していたCD56がCD16を添加したことによって、それがBlockされたということですか。ということは、CD16を添加した後の方が正しいCD56の発現ということのなるのでしょうか。 理解力が低くて申し訳ありません。もう少し力を貸して下さい。

(無題) 削除/引用 No.448-5 - 2009/05/13 (水) 17:33:40 - 経験者 DCさんの意見に賛同します。 anti-CD16.CD32はFc receptorのblocking antibodyとして使われます。 おそらく、anti-CD56がFc R blocker非存在下ではCD56とは別のものに非特異的に結合してしまっており、anti-CD16存在下ではその非特異的吸着がなくなるということになります。 ですので、おそらく CD16存在下でのCD56の染色パターンと、CD16非存在下だけども大量のcontrol IgGを予め入れておいて、CD56で染色するパターンと同じになるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.448-4 - 2009/05/13 (水) 17:16:42 - DC CD16抗体を添加したことで、蛍光が落ちたという事ですので、CD56抗体がFcRへ非特異的に結合しており、その結合がCD16（FcγR�V）抗体の添加によってブロックされた、と考えるのがまず第一ではないでしょうか。

返信ありがとうございます。 削除/引用 No.448-3 - 2009/05/13 (水) 12:25:28 - zetton 返信ありがとうございます。 セレクションはしていないですね。単純にCD3とCD56の発現をドットプロットに表示してQuadrant Statisticsで見ているだけでも、CD56の発現が、ピークが下がっているどころか、ほぼ発現していない状態になるのです。 そうですね、メーカーさんにいくつかのサンプルを提供してくださるか聞いてみます。

(無題) 削除/引用 No.448-2 - 2009/05/13 (水) 09:45:05 - まっくろん 　ちょっと難しいですね。 確認ですが、CD16で陽性・陰性のセレクション（陽性だけ、あるいは陰性だけのCD56を見るような設定）はしてないですよね。あと、CD56の減少ですが陽性細胞のピークは変わらず、細胞数（陽性率）だけ変わっているのでしょうか？それともピーク自体も下がってますか？ 　新しい抗体買うのはやはり慎重になりますよね（お金持ちのラボなら別ですが）。抗体の相性については分かりませんが、メーカーの中にはサンプルをくれるところもあるので、いくつか取り寄せてみて、それで検討してみてもいいかと思います？

FACSのマルチカラー染色について 削除/引用 No.448-1 - 2009/05/12 (火) 13:47:54 - zetton いつも参考にさせていただいております。 知識の少ない私に皆様の力をお貸しください。よろしくお願いいたします。 FACSCaliberでNK細胞についての染色を試みようと思い、CD3（FITC）、CD16（PE）、CD56（PE-Cy5）でPBMCを染色したのですが、CD3、CD56、CD16の3色で染めたものが、CD3、CD56の2色を染めたものと比較して、CD56の発現が大きく減少していました。これは、抗体の組み合わせが悪いのでしょうか。または、他にどのような事が考えられるでしょうか。 抗体はすべてBD社製のものを用いており、実験条件は2色染色、3色染色ともに同条件、同サンプルでおこないました。また、FACSの解析においてもcompensation等の調節も行いました。FACSのレーザーは1種類しか搭載しておらず、4色染色はできません。 抗体の組み合わせが悪いだけなら、違う組み合わせもで購入しようと思っているのですが、何分、抗体は高価なので、簡単には購入できず、原因がわからないことには前に進めません。

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