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(無題) 削除/引用 No.441-9 - 2009/05/12 (火) 13:29:28 - バナナ なるほど、こちらのcDNAを研修先に送ってPCRをしてもらい、それで向こうでバンドが出たら、機械に問題があるということですね。これならできそうなので連絡をとってみようかと思います。 ちなみに酵素に関しては2種類ですが検討してみました。KOD Dashと　EX　Taqですがどちらも検出できませんでした。 どうもありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.441-8 - 2009/05/12 (火) 11:53:09 - おお 読み返しましたPCRマシーンがちがうというのあるのですね。 それでは貴方のcDNAをその研究室に送ってマシーンの違いで PCRがかからなかったのか確認できるのでは? 確かに向こうから送ってもらっても良いのでしょうけど。 マシーンの違いならPCRの条件をいじって改善するしかないですね。 PCRがかからないという相談はこのフォーラムでなんども議論されています ので検索などで調べてみてはどうでしょうか? 私の一番可能性があると思っている方法はPCRの温度とかではなく、 酵素をかえると言った方法です。確かに条件でバッチリ出るように なるような例もありますが、、、

(無題) 削除/引用 No.441-7 - 2009/05/12 (火) 11:39:05 - バナナ RNA,ドライアイス梱包で大丈夫なんですね。初めて知りました。ありがとうございます。 逆転写に関してはポジコンといえるポジコンはなく、検出対象の植物からの精製物をポジコンとしていません。TOYOBOのリバトラに付属しているポジコンを使っている状態です。キット付属のものは純度も高いはずですから、これでバンドが検出できているからといって、検出対象のものの逆転写がうまくいっているとはいえないとおもいます。 私のいる研究室の設備上、ノーザン、ドットブロットなどはできないんです。。。。ごく普通のPCRをするので精いっぱいというところです。ちなみに研修先ではナノドロップを使って測定しましたが、しっかり抽出できていることは確認できました。私のところにはナノドロップはないですが、全く同じやり方で試験をしているので、まぁ大丈夫かなと思っていますが、確実とは言い切れないです。 つかっている試料のウイルス、ウイロイド感染は確実と言っていいと思います。私の研究室のほかに、３つの研究機関に試験を依頼しましたが、３つ中２つからは同じサンプルでウイロイドの陽性反応が得られたと報告が来ています。残り一つは検出できていないですが。

(無題) 削除/引用 No.441-6 - 2009/05/12 (火) 10:27:03 - ~ >RNAそのものを常温で輸送できるかどうか 常温で輸送する必要があるのですか？ ドライアイスや保冷剤を入れて手持ちで運ぶ ヤマト運輸などの冷凍便 などで、冷凍状態を維持したまま輸送することは可能でしょう。 文面を見て海外にまで教わりに行ったわけではないと思いましたが、 もし輸送について制限がかかるのであれば、 その情報を書けば助言してくれる人がいると思います。

(無題) 削除/引用 No.441-5 - 2009/05/12 (火) 08:36:39 - おお 植物は詳しくないですし、ウイロイドにも詳しくないですが、精製、逆転写を 疑うのであればそれなりの工夫、ポジコンを用意した方がいいかもしれません。 RNAの長さは200-ですよね。短いRNAの抽出効率は方法によって可也落ちることが あります。例えばその得られたRNAをノーザンやドットブロットで検出できますか? そのRNAを逆転写してクローニングしたプラスミドがあるなら、T7RNAポリメラーゼを使ってRNA自身を合成すると逆転写のポジコンになるかもしれません。 あるいは試料をRNA抽出用バッファーで溶解した直後にそのRNAをリーズナブルな 量だけ載せれば、精製の過程もモニターできるかもしれませんね。 使っている試料のウイロイドの感染とかは確実なのでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.441-4 - 2009/05/12 (火) 08:23:04 - Pumpkin RNAはエタチンの状態（遠心ペレット下せずに）で常温で運べますよ。米国の配列解析会社に送付した経験が何度かありますが、全てで分解は認められませんでした。 国内であればドライアイス梱包で問題なく送れると思いますが。 しかし、バッファーや水などの水溶液に溶解された状態での常温輸送は激しくお勧めしません。

ご返信ありがとうございます 削除/引用 No.441-3 - 2009/05/11 (月) 19:03:17 - バナナ 教わりに行ったラボ、とは今でも連絡を取っています。なのでサンプルの譲渡自体は問題ないですが、RNAそのものを常温で輸送できるかどうか、、心配になってしまいます。大丈夫なんですかね？？ アニーリング温度の検討はやってみてもいいかもしれませんね。検討してみます。 取り急ぎお礼まで

(無題) 削除/引用 No.441-2 - 2009/05/11 (月) 17:58:02 - ~ 教わりに行ったラボとはいい関係が続いていますか？ １．元のサンプル ２．RNA抽出サンプル ３．cDNA合成サンプル を貰うことはできませんか？ それらを貰えば、どの時点で問題が生じているのかが分かると思います。 わざわざ受け入れて教えてくれたのですから、トランスファーに必要なサンプルの譲渡を断られることはないと思います。 PCR条件を検討するのであれば、どちらかといえばアニーリング温度を下げるところから始めた方がいいような気がします。 コントロールのcDNAは過剰に入れていると思いますので、それで増えているからといって、温度条件が適切であるとはいえないでしょう。

PCR条件の最適化 削除/引用 No.441-1 - 2009/05/11 (月) 17:31:11 - バナナ 現在、花卉に発生するRNAゲノムのウイルス、またウイロイドというウイルスよりも更に小さな病原体の検出を試みているものです。特にウイロイドの検出ができなくて、とても困っております。 以前、他の研究室で研修をさせてもらった時にはできたのですが、自分のところに戻ってきてから再度同じことをすると、ウイルスの方は検出できてもウイロイドの方は全く検出できません。ですが、研修先からもらってきたウイロイドcDNA（つまりコントロール）は毎回しっかりと検出できています。 使用している実験キットは全く同じで、プロトコールも同じようにやっています。ですが、PCRの機械だけは、全く違うもので、うちのは10〜15年くらいのタカラのTP3000というすでにサポート切れのポンコツPCRで、研修先のものはABIの9700です。 機械に問題がある可能性は言うまでもないのですが、うちのポンコツでもコントロールがしっかりと出ているということはPCR以降（いずれの検出対象もnested-PCRもしています）の反応はうまく行っていると判断できると私は考えています。なので、RNA抽出→cDNA合成の段階で何かうまくいっていないことがあるのではないかと推測していますが、皆様はどうお考えですか？ 研修先と同じプログラムで逆転写反応もしていますが、機械が変わったことによって逆転写の効率が落ちたのでしょうか？ですが、もうひとつの検出対象であるウイルスの方はRNA抽出→cDNA合成→PCR→nested-PCRと問題なく検出できています。 こういった場合どのようなアプローチの仕方でトラブルシューティングしていったらよいか、アドバイスいただけないでしょうか、、。よろしくお願いいたします。 ウイロイドに関しては、今まで最適化を試みてきました。たとえば、primerや酵素の量を少しずつ変えて試験してみたりとか、逆転写においてテンプレートRNAを増やしてみたりとか。この程度ですが。 どんなことでもいいのでアドバイスをお願いいたします。

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