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(無題) 削除/引用 No.434-18 - 2009/05/15 (金) 16:38:15 - スパロウ 皆様、いろいろな御意見、御助言をいただきまして、本当にありがとうございました。当初のトピックである「AD-plasmidのrescueができない」という内容からは少々外れてしまいましたが、それを超えるような知識をえることができましたので、ここらで解決とさせていただきます。 また質問させていただく可能性がヒジョーに高いので、その時は宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.434-17 - 2009/05/14 (木) 22:27:22 - スパロウ 弘法　様 非常に御丁寧な解説をありがとうございました。なんかこれでようやくシステムの理解が出来たような気になっておりますが、しかしこの内容は弘法様のような詳しい方に聞かないと、酵母初心者には入手困難な情報ですね。販売業者（タ○ラバイオ）のカスタマーサービスに電話したりしてなんとか解決しようとしましたが、結局大した回答が得られなかったので、とっても勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.434-16 - 2009/05/14 (木) 10:31:21 - 弘法 言葉足らずでしたので追加します。 「ポジコンですら極めて生育しにくくなる」という表現には、（１）生育が遅くなる（コロニー形成率は悪くない）と、（２）コロニー形成率が悪くなる（生えてきたものの生育は遅くない）、あるいは（３）その両方、という解釈があり得ると思いますが、この場合に起こっていることは（２）です。plating efficiency（コロニー数／まいた形質転換体の数）が低いと言います。

(無題) 削除/引用 No.434-15 - 2009/05/14 (木) 10:14:40 - 弘法 状況がわかりました。 > 弘法様の御助言から邪推しますと、形質転換後にいきなり-LWHAに播種するとポジコンですら極めて生育しにくくなる、と考えることができますが、こういうものなのでしょうか。 邪推というか、まさにその通りです。陽性のプラスミドが酵母に形質転換されたとして、His+かつAde+になるためには、まずbaitタンパク質とpreyタンパク質がそれぞれ十分量発現し、両者がHIS3とADE2という２つのレポーターのプロモータで相互作用することで転写を誘導し、His3とAde2タンパク質が十分に蓄積し、それによって触媒される代謝が進行して十分量のHisとAdeが供給されるようになるという長ーいステップが必要で、いきなり選択を掛けるとハードルを越えることができない場合もあります。さらに厄介なことには、ADE2レポーターはかなり閾値が高く、たとえ陽性たり得るpreyであっても、preyプラスミドのコピー数が最適化されて初めてレポーターを十分に活性化できるという場合もあり得ます。-LWHで一次選択をしておいてそれを-LWHAdeで二次選択するというのは、一次選択の間にこの最適化が起こることを期待するという面もあります。 ただし、持ち込み、あるいは蓄積しているHisとAdeの量でHis3とAde2の発現を待つ間が十分しのげて、-LWプレートと-LWHAdeプレートにおけるコロニー数にそれほど大きな開きがないという場合も、前培養・後培養の条件によってはあり得ます。でも、それに期待するより、危ない橋を渡ることは避けた方が賢明だと思います。 > さっき計算してみましたが、-LW plateではおよそ10^5 cfu/ug DNAで生えてきているようです。 それなら効率は悪い方ではないと思います。

(無題) 削除/引用 No.434-14 - 2009/05/14 (木) 09:01:01 - スパロウ 弘法　様 > ポジコンのプラスミドの形質転換体は-LWで生えてくるんですよね。このときコロニー数はどのくらいですか。-LWで生えてきたコロニーから-LWHAdeのプレートにストリークしたら、今度は生えますか。これで生えないなら、ポジコンのプラスミドか酵母株のいずれかに問題があります。これで生えるなら問題はそこではありません。 ちょうど上記内容の実験をやっていました。さっき計算してみましたが、-LW plateではおよそ10^5 cfu/ug DNAで生えてきているようです。現在は生えてきたコロニーを-LWHA plateにストリークした直後ですのでまだ結果はわかりません。 > それから、baitを予め形質転換した株に、preyとしてcDNAとvectorを共形質転換するシステムなんですよね。Clontechのマニュアルをきちんと読んだことがないのですが、形質転換操作の後（ヒートショック処理の後）、どのような手順を踏んでどのプレートにまき出していらっしゃいますか。直接、-LWHAdeにまいていらっしゃるのでしたら、まず-LWHにまいて生えてきたコロニーを-LWHAdeにレプリカすることをお勧めします。 経過説明が不十分で申し訳ございませんでした。 使用しているキットは仰るようなシステムです。形質転換操作後はYPDAのような付属の培養液に再懸濁し、30℃で1時間回復を行い、洗浄後に播種しています。これまでに行っているライブラリースクリーニングは、1回目は-LWHで行い、生えたクローンを-LWHA plateにストリークし、そこで生えたものを陽性クローンとしました。以降の解析についてマニュアルには、-LWHAで生えてくる陽性クローンからAD-plasmidを取り出し、AH109にbait plasmidと共に再導入してre-testするように書いてありました。現在取得している陽性クローンはすべてのマーカーが陽性ですので、re-testではいきなり-LWHA plateに播種すればいいと理解し、AD-plasmid調製と並行して、まずはポジコンが生えるかどうかを見ていたところです。弘法様の御助言から邪推しますと、形質転換後にいきなり-LWHAに播種するとポジコンですら極めて生育しにくくなる、と考えることができますが、こういうものなのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.434-13 - 2009/05/13 (水) 11:40:21 - 弘法 どうも一貫して話がかみ合っていないような気がしてならないのですが。 ポジコンのプラスミドの形質転換体は-LWで生えてくるんですよね。このときコロニー数はどのくらいですか。-LWで生えてきたコロニーから-LWHAdeのプレートにストリークしたら、今度は生えますか。これで生えないなら、ポジコンのプラスミドか酵母株のいずれかに問題があります。これで生えるなら問題はそこではありません。 それから、baitを予め形質転換した株に、preyとしてcDNAとvectorを共形質転換するシステムなんですよね。Clontechのマニュアルをきちんと読んだことがないのですが、形質転換操作の後（ヒートショック処理の後）、どのような手順を踏んでどのプレートにまき出していらっしゃいますか。直接、-LWHAdeにまいていらっしゃるのでしたら、まず-LWHにまいて生えてきたコロニーを-LWHAdeにレプリカすることをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.434-12 - 2009/05/13 (水) 11:10:10 - スパロウ 御世話になっております。 返信が遅れてしまい、申し訳ございません。意外に忙しかったもので・・・。 おお様 現状は仰る通りで、SD/-Trp-Leuでは普通に生えるのですがSD/QDO（-Ade-His-Trp-Lru）では殆ど生えてくれません。ライブラリー形質転換時はそこそこイケていたのが救いです。ひょっとしたらpGBKT7-p53を入れたAH109がおかしくなっているのかもしれませんね。プラスミドも含めて一度チェックしてみます。 弘法様 > 形質転換効率が低すぎるのではないでしょうか。 確かに効率は低いです（泣。それを改善するためにPEG再調製やら何やら条件を変えて形質転換を繰り返していますが、なかなか良い条件が見つかりません。というか、（おお様が言われるように）しっかりしたポジコンをマニュアルに従って形質転換しているだけなので、変な条件設定をする必要は基本的にありませんよね。では何故SD/QDOで生えないのか？ということで培養液や培養環境、菌体密度まで疑ってみましたが、特に変な部分は見当たりません。やはりプラスミドが原因と考える方が良いような気がしてきました。所属ラボで酵母を扱った経験がある者がおらず（自分も含めて）、極めて基本的な部分で戸惑っているのも事実ですので、もし何か重要なコツがあるのでしたら、ご教授いただけると物凄くうれしいです。

(無題) 削除/引用 No.434-11 - 2009/05/12 (火) 11:14:09 - 弘法 えーと、ライブラリー形質転換の成否は-LWプレート（希釈してごく一部をまき出す）のコロニー数で評価できますよね。 それとも、ポジコンの形質転換で-LWプレートにもほとんどコロニーが出ないんですか？形質転換効率が低すぎるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.434-10 - 2009/05/12 (火) 02:37:07 - おお ポジコンにしようと考えたDNAの酵母への形質転換がうまくい 行かないのでしょうか。 クローンが得られるけど-Adeなどの状態で増えないということでしょうか。 クロンテックのポジコンのプラスミドはたしかp53とLargeTantigenを使っていて (ほかのポジコンもあるかもしれませんが)非常にしっかりとしたポジコンになっています。 もしほかのプラスミドで酵母への形質転換がうまくいっているようでしたら プラスミドからチェックしてみてはどうでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.434-9 - 2009/05/11 (月) 21:25:50 - スパロウ > ポジコンが生えないとはどのような状況を指しておられますか。PEGを再調製することは、形質転換効率を改善するためには有効でも、得られた形質転換体のレポーター活性に影響があるとは思えないのですが。 ポジコンが生えない状況ですと、サンプルDNAを用いたトランスフォーメーションが全滅だった場合、反応自体が失敗だったのかそのサンプルDNAがinteractionしないクローンだったのかの判別がつかないからです。Y2Hのre-testの場合、コントロールには菌体のみ、空ベクター導入株、それとbaitベクター導入株の３つがあれば良いと考えられますが、そこに必ずinteractionが起こるものをポジコンとして置けば、失敗したときに原因が考えやすくなると思いますが・・・。そのような理由でキット添付のポジコンを使用していますが、なかなか生えてくれないもので難渋しています。

(無題) 削除/引用 No.434-8 - 2009/05/11 (月) 17:58:27 - 弘法 ポジコンが生えないとはどのような状況を指しておられますか。PEGを再調製することは、形質転換効率を改善するためには有効でも、得られた形質転換体のレポーター活性に影響があるとは思えないのですが。

(無題) 削除/引用 No.434-7 - 2009/05/11 (月) 08:30:50 - スパロウ おお様 > > イーストからとったDNAを直接PCRしてインサートを増幅 > これは盲点でした。早速やってみます。 先日この実験をやってみたところ、バンドを検出することができました。これで先に進めそうです。どうもありがとうございました。 それと、以前このフォーラムで見たことがあるのですが、確か同じクロンテックのシステムによるY2Hで、ポジコンが生えないというトピックだったと思いますが、実は私も同じ現象に遭遇しております。PEGを再調整してみても生えないので困っています。何か解決策を御存じの方、ご教授願えませんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.434-6 - 2009/05/09 (土) 08:38:16 - スパロウ 弘法様 御助言ありがとうございます。 > Amp耐性の大腸菌のコロニーがしっかり生えていて（別のAmpプレートにストリークし直してもO/Nでコロニーが出る）、そのコロニーのコロニーPCRでインサートが確認できるなら、そこまでのステップはＯＫだと考えるのが自然ではないでしょうか。 そうですね。しかし出現する大腸菌コロニー数が少ないので、おお様のご意見も参考にして、現在は手っ取り早く解決しそうなイーストクローンから調整したDNAを用いPCRでのインサートチェックをやっている最中です。後のことも考えるとplasmidがほしいところですが、これでうまくいけたら、PCR産物のシークエンスに移ろうかと思います。 > 大腸菌の株としてひょっとしてKC8かHB101をお使いで、そのせいでキットで十分に不活性化されなかったendA産物がDNAを分解しちゃっている 確か栄養選択でAD-plasmidを選別できますからKC8やHB101があればぜひ使いたいところでしたが、残念ながら全てDH5aで済ませています（titerも落ちてきていますが）。ですのでendAについては全く考慮していませんでした（笑。

(無題) 削除/引用 No.434-5 - 2009/05/08 (金) 18:44:57 - 弘法 ひとつ思いついたことがあります。 大腸菌の株としてひょっとしてKC8かHB101をお使いで、そのせいでキットで十分に不活性化されなかったendA産物がDNAを分解しちゃっているってことはありませんか？他のプラスミド調製の時にはendA-の株を使っているから大丈夫だということになりますが。

(無題) 削除/引用 No.434-4 - 2009/05/08 (金) 11:59:31 - 弘法 Amp耐性の大腸菌のコロニーがしっかり生えていて（別のAmpプレートにストリークし直してもO/Nでコロニーが出る）、そのコロニーのコロニーPCRでインサートが確認できるなら、そこまでのステップはＯＫだと考えるのが自然ではないでしょうか。 理由は分かりませんが、ミニプレップでのプラスミドの収率が低いだけかもしれないので、少し大きなスケールからプラスミド調製してみてはいかがですか。 また、根本的な解決策ではありませんが、「このステップでは大腸菌コロニーで10個ずつくらいはインサート確認をしたい」ということに関しては、10個ずつくらいコロニーPCRすれば良いのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.434-3 - 2009/05/08 (金) 08:44:10 - スパロウ おお様、早速のご意見ありがとうございます。 > PCRでインサートが確認できたのか > よく分からないです。 すみません。文書足らずでした。実際は数クローンのインサートが確認できています。しかし、yeastクローンに複数のAD-plasmidが含まれている可能性も考慮しているので、このステップでは大腸菌コロニーで10個ずつくらいはインサート確認をしたいのです。で、10個拾っても1つもplasmid精製できないものが多いというわけです。 > プラスミドが抽出できていればいいのでゲノムは必要ないですよ。 > 簡便なほうほうで確かクロロフォルムとグラスビーズでボルテックスし > エタチンという方法があったようにおもいます。 Plasmidを含むDNAということで、PCIとグラスビーズでボルテックスし、上清をエタ沈しています。たしか実験本にはゲノムDNAと書いてあったような気がしますが、実際はゲノムDNAじゃないんでしょうかね。キット使用も考えます。 > イーストからとったDNAを直接PCRしてインサートを増幅 これは盲点でした。早速やってみます。 > BDのプラスミドは拾わないシステムでしょうか? > 大腸菌トランスフォーメーションのネガティブコントロール このシステムでは、BD-plasmidはカナマイシン耐性でADの方はアンピシリン耐性遺伝子を含んでいます。ですのでLB/Ampで選択できるようですし、BDを拾う頻度も低いようです。形質転換のネガコンはDNAなし菌体のみで、増殖しないことを確認しています。 > そもそもBDプラスミドを維持する必要がない 全くその通りですね。一応そこも考えてSD/-Leuは作ってあるのですが、きちんと選択圧をかけたほうがいいのでは？と思い、QDOで増やしていました。-Leuのみのほうがよく増えそうですね。やってみます。 > それと生き残ったイーストが生えてきているとか、、、、 大腸菌コロニーの液体培養後に匂いを嗅いでみましたが、酵母の匂いはしませんでした。まさかPCIで核酸抽出した溶液中で生き残っているのでしょうか（汗。

(無題) 削除/引用 No.434-2 - 2009/05/08 (金) 01:45:17 - おお >[Re:1] スパロウさんは書きました : 。 > 問題はここからで、陽性クローンの液体培養（SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His;QDO)後、AD-plasmidを含むyeast genomic DNA抽出、大腸菌への導入・Ampによるコロニー選択、AD-plasmid抽出、コロニーPCRでインサートサイズ確認、そしてシークエンスと進む予定でしたが、AD-plasmidがほとんど取れません。Miniprep kitはプロメガのものを使用しておりますが、他の実験系では問題なく精製できています。 お書きななった文章からではPCRでインサートが確認できたのか よく分からないです。 >yeast genomic DNA抽出 ほんとにゲノムを抽出しているのですか? プラスミドが抽出できていればいいのでゲノムは必要ないですよ。 簡便なほうほうで確かクロロフォルムとグラスビーズでボルテックスし エタチンという方法があったようにおもいます。 イーストからのプラスミド抽出用きっとが売ってますね。 イーストからとったDNAを直接PCRしてインサートを増幅 できるならまずそのPCRフラグメントの配列を読むのも 手だと思います。そうするとステップは可也省けます。 BDのプラスミドは拾わないシステムでしょうか? システムによっては培養条件でキックアウトできるものとか 薬剤耐性マーカーが違うとか、大腸菌の栄養要求性 で選択できるとかいろいろあるようですが、、、 >（SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His;QDO) そもそもBDプラスミドを維持する必要がないので ADEやHISとTRP(or Leuどっちだっけ)を落とす必要がないと思います。 大腸菌トランスフォーメーションのネガティブコントロールは とってますか? それと生き残ったイーストが生えてきているとか、、、、

Y2H後のprey vectorレスキューについて 削除/引用 No.434-1 - 2009/05/07 (木) 20:06:28 - スパロウ いつも参考にさせて頂いております。 さて、私はあるタンパク分子の結合パートナー探しでY2Hにトライしています。 ClontecのGal4システム（library construction & screening kit）でスクリーニングし、最終的に十数個のAde+/His+/MEL1+クローンを得ております。 問題はここからで、陽性クローンの液体培養（SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His;QDO)後、AD-plasmidを含むyeast genomic DNA抽出、大腸菌への導入・Ampによるコロニー選択、AD-plasmid抽出、コロニーPCRでインサートサイズ確認、そしてシークエンスと進む予定でしたが、AD-plasmidがほとんど取れません。Miniprep kitはプロメガのものを使用しておりますが、他の実験系では問題なく精製できています。 原因については、Ampの効力低下のためサテライトコロニーを拾った可能性なんかを考えてみましたが、作り直したLB/Amp plateでも同様の事態に陥っています。少数ですがコロニーは生えてきますので、Amp耐性をもたらす何かが大腸菌内に導入されているようですが、プラスミド精製が不可能な理由がわかりません。酵母内で何か起きているのでしょうか。 このような事態に遭遇した経験がおありな方、また聞いたことがある方のご助言をお願い致します。

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