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ありがとうございました！ 削除/引用 No.430-7 - 2009/05/07 (木) 17:10:00 - spika 沢山の分かりやすいお返事ありがとうございます。また、説明不足な点があり申し訳ありませんでした。 ミュータントはENU処理によって得られたもので、表現系解析の一環である種の細胞を特異的に光らせた魚と掛け合わせてありました。私は、その子孫同士の交配を行ってキャリアを同定するという段階からお手伝いに入ったもので、色々と考えてしまった次第です。ミュータントの中にはhomozygoteでもviableなものがおり（これらの多くは生きた状態でミュータントか否かの判断が不可能）たとえ目的のミュータントにおいて特定の細胞が光っていたとしても、観察の段階ではミュータントか否かの判断がつかず、結局ランダムに観察してその後適当な染色（もともとミュータントを選別した際に用いた染色法）により、事後判断という形になってしまいます。この点に関してはもう少し工夫が必要そうです。 いずれにせよ、皆様のご親切な御指摘、大変ためになりました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.430-6 - 2009/05/07 (木) 04:43:06 - おお >[Re:5] APさんは書きました : > > 完全長のタンパク質にレポータを融合するのは、標的タンパク質の機能を保ったままにしたい、あるいは細胞内局在を保ちたい場合に限られると思います。それがうまくいくかどうかはケースバイケースでしょう。GFPなんかは確か4量体で働くので難しい場合もあるようです。 gene trapみたいな事やってんのかなとかちょっと思ったりします。 質問主のもう少し詳しい説明が欲しいですね。

(無題) 削除/引用 No.430-5 - 2009/05/06 (水) 15:59:24 - AP >まず、組織特異的もしくは細胞特異的に細胞を光らせたい場合に用いるGFPやDsRedは生体内においてもともとターゲットプロモーター(仮にプロモーターAとします）の下流にあるタンパク質 Aとの融合タンパクとして合成されると思いますが、この場合、レポーターをくっつけたタンパク質Aの機能は損なわれないのでしょうか（構造の変化等によって）？ 組織特異的・細胞特異的な発現をレポータでモニタするだけなら、標的遺伝子の転写調節配列（プロモータなど）だけあればいいわけで、それに直接レポータ遺伝子をつないでもいいわけです。多くの場合は、人工のコンストラクトでも確実に翻訳に行われるように、また翻訳調節の可能性も考えて5' UTRプラスN末端のペプチドに融合させると思いますが、この目的では完全長の標的タンパク質や機能の保存は必要ありません。Knock-inなどで内在性の遺伝子にレポータ遺伝子を入れる場合でも、Knock-inがdominant-negativeに働くのでもなければ野生型遺伝子とヘテロ接合にすることで機能を保ったままモニタできます。 完全長のタンパク質にレポータを融合するのは、標的タンパク質の機能を保ったままにしたい、あるいは細胞内局在を保ちたい場合に限られると思います。それがうまくいくかどうかはケースバイケースでしょう。GFPなんかは確か4量体で働くので難しい場合もあるようです。

(無題) 削除/引用 No.430-4 - 2009/05/06 (水) 14:43:38 - もー タンパク質の機能を気にするのであれば、 目的タンパク質cDNA--IRES--レポータータンパク質 みたいなコンストラクションはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.430-3 - 2009/05/06 (水) 07:46:43 - 通りすがり >この場合、レポーターをくっつけたタンパク質Aの機能は損なわれないのでしょ >うか（構造の変化等によって）？ まあ、タンパクの種類によってそうなるともいえるし そうならないともいえます。 なんというかやってみないとわからない話です。 ただフレームを合わせてリンカーなどの長さを調節したり monomer typeのものなどを利用すれば 機能を維持かもしくは近い状態にすることは最近だとわりと可能です。 ちなみにもともとそういう目的で作ってるのかどうかはわかりませんが、 >組織特異的もしくは細胞特異的に細胞を光らせたい場合に用いるGFPやDsRedは >生体内においてもともとターゲットプロモーター(仮にプロモーターAとしま >す）の下流にあるタンパク質 Aとの融合タンパクとして合成されると思います あんまり普段、組織特異的に光らせる目的の場合、"ターゲットプロモーターの下流にあるタンパク質"と融合させることはあんまししないです、 手間がかかるのとタンパクAの細胞内での局在が特定のオルガネラなどに限局されてる因子の場合、本来の目的の細胞を光らせる目的が損なわれるので。 普通はtrasngeneとしてpromoter-GFP/DsRedだけで発現させるのが常です。 融合タンパクとして発現させるのは組織特異的なpromoterの領域がよくわかっていないためknock-inでGFPなどを組み替えの形で挿入させるときぐらいですがzebraのscreeningで、そんなやり方やってるラボって あんまり聞いたことないですが。

(無題) 削除/引用 No.430-2 - 2009/05/06 (水) 07:36:25 - おお タグを入れた融合タンパクを染色体上に相同組み替えで作るということであれば 一般化してあるとかないとかいえるものではありません。 ただし、相同染色体が2本ある場合へテロであればもう一本の染色体 からのは正常なタンパクが発現しているでしょうから 正常か比較的マイルドなフェのタイプが期待できるのでは ないでしょうか。 タグをいれたタンパク質にかんして、IPや活性に関する 一般的な注意をお考えになればいいかと思います。

トランスジーン（レポータージーン）の発現様式 削除/引用 No.430-1 - 2009/05/06 (水) 06:41:13 - spika ゼブラフィッシュのラボで短期でミュータントスクリーンの仕事をすることになりました。 この分野は全くの素人でイマイチ把握できていないのでお返事宜しくお願いします。 まず、組織特異的もしくは細胞特異的に細胞を光らせたい場合に用いるGFPやDsRedは生体内においてもともとターゲットプロモーター(仮にプロモーターAとします）の下流にあるタンパク質 Aとの融合タンパクとして合成されると思いますが、この場合、レポーターをくっつけたタンパク質Aの機能は損なわれないのでしょうか（構造の変化等によって）？ 宜しくお願い致します。

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