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(無題) 削除/引用 No.424-17 - 2009/05/12 (火) 11:02:39 - 通りがかり 実験のことは何でもそうかもしれませんが、想像でものを言っているのか、経験でものを言っているのか、どちらをもとに言っているのかを示さないと訳が分からなくなります。 ということで、私も経験からくる根拠があるのであれば聞いてみたいです。

(無題) 削除/引用 No.424-16 - 2009/05/12 (火) 10:38:35 - おお >[Re:15] 単純にさんは書きました : > その感覚というのが、実際に経験したことからなのか？ > ということをお聞きしたいのです。 私はFACSの経験はありませんと申し上げてますので、あくまでも 可能性です。で体積あたりのシグナルで考えるなら科学的だとも思います。 あとは受け入れる側におまかせします。

(無題) 削除/引用 No.424-15 - 2009/05/12 (火) 10:33:40 - 単純に その感覚というのが、実際に経験したことからなのか？ ということをお聞きしたいのです。 別に非難ではなく、そういうことが他人に提供する情報であると思うのですが・・・。

(無題) 削除/引用 No.424-14 - 2009/05/12 (火) 09:09:40 - おお >[Re:13] 単純にさんは書きました : > ＞想定している細胞の種類・抗原の局在のあり方 > > 私にはよくこの理屈がわかりませんし、経験がありません。 > 局在に関しては、例えば核に1〜数個ドット状に染まるような場合だと、ドット自身は強く光っていても、細胞全体の体積に対してのシグナルが弱くなりますので、顕微鏡での感度は総体的に上がるものと思います。核でなくてもそう言う染まり方をするのは同様ではないでしょうか。 というのが私の感覚ですが、、、、、

(無題) 削除/引用 No.424-13 - 2009/05/12 (火) 08:52:07 - 単純に ＞想定している細胞の種類・抗原の局在のあり方 私にはよくこの理屈がわかりませんし、経験がありません。 では、どのような細胞、抗原でのご経験でしょうか？ 私は経験でものを言うのが研究者だと思いますので、当然ご経験があると思います。 それを聞きたいのです。お願いします。 もし、単なる勘とかいった類いでしたら、参考になりませんよね。 そういうことは、ちゃんとそう断って書いていただかないと、質問者等に迷惑です。 そうでないと思いますので、ご教授ください。

(無題) 削除/引用 No.424-12 - 2009/05/12 (火) 02:58:37 - おお >[Re:11] Tbさんは書きました : > > FACS＜蛍光顕微鏡 > といっているのではなく、 > > > FACS>>>>共焦点レーザー顕微鏡>蛍光顕微鏡 > の ">>>>" には必ずしも同意しないと書いたつもりでした。 > > 想定している細胞の種類・抗原の局在のあり方とかが単純にさんと違うのだと思いますし、言葉のとらえ方もかかっわてきているようですので、いきすぎがあったならばお詫びいたします。 横ですこの手の実験は経験がないですが、興味ぶかく読ましていただいてます。 感覚的ですが、 > > FACS>>>>共焦点レーザー顕微鏡>蛍光顕微鏡 > の ">>>>" には必ずしも同意しないと書いたつもりでした。 この記載は分かるような気がします。 抗原や見たいターゲットによって変わりそうだなと、、、、

すいません 削除/引用 No.424-11 - 2009/05/11 (月) 20:44:08 - Tb > FACS＜蛍光顕微鏡 といっているのではなく、 > FACS>>>>共焦点レーザー顕微鏡>蛍光顕微鏡 の ">>>>" には必ずしも同意しないと書いたつもりでした。 想定している細胞の種類・抗原の局在のあり方とかが単純にさんと違うのだと思いますし、言葉のとらえ方もかかっわてきているようですので、いきすぎがあったならばお詫びいたします。 もしラボがお隣どうしならば、「ではちょいとやってみましょう」となるのですが・・・

(無題) 削除/引用 No.424-10 - 2009/05/11 (月) 12:24:23 - 単純に ＞この場合も、蛍光顕微鏡用のサンプルは生細胞ではなく固定、界面活性剤処理してませんか？ いいえ。そんなものと比較しますかね。 FACSと蛍光顕微鏡で観察するサンプルが同じ条件でないと比較できないっすよ。 ＞レポーターとしての細胞質内で可溶性発現させているGFPは条件によってはかなり流れ出てしまいます。 これは常識です。考慮に入れないわけありません。 ＞あるいは、開口率の低い低倍レンズで培養プレートをそのままみているか・・・？ いいえ。そこまでバカにされなくても。 BD Caliburが基準機？それはよくわからないですが、 私はCaliburだけでなく、いろいろ使っています。 顕微鏡もいろいろ使っています。 また、ソーティングしてきた細胞集団を顕微鏡で見るといった作業もよくやります。 ついでに、知り合いにFACS使いも多く、その人たちとの意見の一致です。 ＞FACSはBD Caliburが基準機となるのに対して蛍光顕微鏡システムはいろいろありますから、そういうこともあるとは思いますが、 こういうことをおっしゃっているのに ＞これが一般論であるならば同意しかねます。 どのような経験でそのようなことをおっしゃっているのでしょうか？ 蛍光顕微鏡システムがいろいろあるというコメントから考えて、一般論ではないとおっしゃるということは、 FACS＜蛍光顕微鏡 という蛍光顕微鏡のシステムをご存知ある、使った経験があってコメントされたということですよね？ 是非、教えてください。そのような顕微鏡が欲しいですから。

GFP 削除/引用 No.424-9 - 2009/05/08 (金) 20:43:25 - Tb 単純にさん、 > 私はGFPを発現させた細胞をFACSと蛍光顕微鏡で解析したことがあります。 この場合も、蛍光顕微鏡用のサンプルは生細胞ではなく固定、界面活性剤処理してませんか？レポーターとしての細胞質内で可溶性発現させているGFPは条件によってはかなり流れ出てしまいます。 あるいは、開口率の低い低倍レンズで培養プレートをそのままみているか・・・？ > FACS>>>蛍光顕微鏡 FACSはBD Caliburが基準機となるのに対して蛍光顕微鏡システムはいろいろありますから、そういうこともあるとは思いますが、これが一般論であるならば同意しかねます。 よっしーさん、 > 退色も考慮に入れないといけないと思います． もちろんです。私は自家蛍光の理屈はFACS蛍光顕微鏡も同じと書きましたが、同じ色素が使えると言った訳では有りません。PEを蛍光顕微鏡で使うとはそもそも想定外でした。顕微鏡ではAlexa594, Alexa647を、FACSではAPC, Alexa647、あるいはそのタンデム型を意識してました。

(無題) 削除/引用 No.424-8 - 2009/05/08 (金) 17:32:50 - よっしー 私も単純にさんと同意見です． FACS>>>>共焦点レーザー顕微鏡>蛍光顕微鏡 蛍光顕微鏡で観察する場合は， 退色も考慮に入れないといけないと思います． 蛍光顕微鏡で退色が早すぎてPEのシグナルは見れませんよね． でもFACSの場合は緑より蛍光強度が強いですよね． なんとなく励起の問題ではなく，検出の違いのような気がするのですが．

(無題) 削除/引用 No.424-7 - 2009/05/08 (金) 16:02:21 - 単純に なんか、質問の答えになっていないような難しい解答が多いので、単純に。 私はGFPを発現させた細胞をFACSと蛍光顕微鏡で解析したことがあります。 FACSで取り込んだ細胞をヒストグラムで示した時、 FACSでコントロールに比べて10倍（10の１乗）の明るさの細胞は、蛍光顕微鏡でほとんど見えませんでした。 100倍（10の２乗）の明るさの細胞は、蛍光顕微鏡で見えます（シグナルかなと思える程度）。 1000倍（10の3条）の明るさの細胞は、蛍光顕微鏡ではっきり見えます。 私の印象では、検出感度は FACS>>>蛍光顕微鏡 です。 参考までに。

(無題) 削除/引用 No.424-6 - 2009/05/07 (木) 22:58:08 - gygy 皆様わざわざお時間を割いてのコメント、アドバイスありがとうございます。私にはまだ知識や経験がなく理解できていない部分がありますが、 皆さんの文章を熟読します。

自家蛍光 削除/引用 No.424-5 - 2009/05/07 (木) 21:44:42 - Tb 自家蛍光は短波長の励起で強く起こるので、自家蛍光が問題になる場合は、色素をFITCからもっと長波長励起のものに換えると驚くほどきれいになります。これはFACSでも蛍光顕微鏡でもどちらにも当てはまります。

訂正 削除/引用 No.424-4 - 2009/05/07 (木) 01:30:39 - Tb 先ほどの投稿で、暗黙のうちにisotype controlのシグナルは unstainと同等レベル、と仮定して書いてしまいました。細胞によってはisotype controlでバカッとシフトするものもありますね。すいません。ただ、この場合も検出器の感度の問題ではなくて、バックグラウンドとシグナルのレベルが問題ということです。

(無題) 削除/引用 No.424-3 - 2009/05/07 (木) 01:24:36 - Tb FACSでみえないレベルのシグナルが蛍光顕微鏡で見えたというのは少し考え難いかなと思います。FACSで、unstainあるいはisotype controlで出てくるピークは検出器の電気ノイズではなく細胞の自家蛍光です。ですから、FACSでunstainあるいはisotype controlと変わらないというのは、染色レベルが自家蛍光より低いということです。そのようなレベルの染色が蛍光顕微鏡で見えたとして、それが特異的染色という自信はなかなか持てないと思います。 "み"さんが書いておられますが、それよりもトピ主さんの場合は染色の方法が違うことによるノンスペをみているように思います。細胞表面を染めるFACSはまず間違いなく生細胞の状態で染めますが、顕微鏡観察の場合は抗原の局在を保つため固定を一番はじめにするはずです。たいていはpermeabilizeもするでしょう。この差はノンスペの出方に大きく影響します。 あとisotype controlというは古いFACS屋は絶対視する傾向がありますが、あれはただの参考値です。市販のisotype control Abはもっともノンスペの低いisotype controlクローンを選んで販売していると思われますので、これと比較してシフトしているからといって信用するのは危険です。ノンスペの程度はここのクローンによりピンキリです。結局は、特異性の判断は、“総合的に”するしかないと思います。

(無題) 削除/引用 No.424-2 - 2009/05/06 (水) 17:34:11 - み レーザー強度・Offsetなどの設定は2機器間で厳密に統一できるのでしょうか？比較するのは難しい気がしますが。 そもそも、細胞表面のエピトープを認識するとのことですから、FACSでは固定無しで穴あけも無しということでしょうか。 一方、顕微鏡での観察の方は固定後に染色されているのでしょうか。 だとすると染色条件自体が異なり、検出感度だけの比較ではないですね。 細胞染色には使用できるがFACSでは使用できないなど、抗体の性質決定は慎重にやらないと危険ですよ。 シグナルの特異性もknockdown,knockoutなどのマテリアルを併用して証明していかないと、固定の条件だけでもシグナル強度は違ってきますし、染色の定量性を論じるのも容易くない。FACSの方がピークのズレで「シグナル強度が異なる」と論じるのは容易いのでしょうが。

検出感度の差（蛍光物質） 削除/引用 No.424-1 - 2009/05/04 (月) 00:21:04 - gygy ふと疑問に思ったことがあったので質問致します。 私は最近研究を開始した者なのですが、蛍光物質の付いたモノクロで細胞表面の抗原を検出するとき、フローサイトメーターと蛍光顕微鏡ってどちらが検出感度が良いのでしょうか？ 現在、ある抗原に対するFITC標識の抗体を用いて検出を行っているのですが、フローサイトメーターでアイソタイプコントロールと同じレベルでも、蛍光顕微鏡だと励起の幅にも拠りますが、「あれ、これはコントロールより光っているのかな」と思うことがあります。 皆様の経験等をお聞かせくだされば幸いです。

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