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(無題) 削除/引用 No.423-9 - 2009/05/05 (火) 21:29:44 - おかめ PCR様、mm様、ご意見ありがとうございます。 ＞DMSOは5%と10%を試せば良いと思います。 　この濃度で検討してみます。ところで、DMSOがPCR増幅(polymerase)の正確性に影響を与える可能性があると聞いたことがあるのですが、どの程度のものかご存知でしょうか？ ＞ミスリーディングを防ぐ方法 　状況に応じて、順次、試してみたいと思います。4．まで行かなければ良いのですが・・・

(無題) 削除/引用 No.423-8 - 2009/05/05 (火) 18:32:06 - mm ミスリーディングを防ぐ方法 １．アニーリング温度を上げる ２．中間部に制限酵素サイトを付けたprimerを設定し、5'側、3'側の２フラグメントを増幅し、ligationにて完成させる。 ３．端に欠損しやすい配列があるのであれば、そこを含むPCRを避ける。まず、短いフラグメントを作製。その後、（最終産物を作製するには）欠損しやすい部分を含む、長いオリゴを用いて再度PCR（これは最長100 mer程度まで） ４．どうしてもうまく行かないときは、クローンを購入し（安い会社は１−２万円で購入可能）、必要な部分のみPCRで作製（例えば制限酵素サイトを入れたりなど）。その後、すでにクローニング済みの遺伝子と、制限酵素サイトを利用した遺伝子組み換え操作で完成させる。 ・・・・など、状況によっては、まだやる余地はあるように思います。

(無題) 削除/引用 No.423-7 - 2009/05/05 (火) 13:19:11 - PCR DMSOは5%と10%を試せば良いと思います。 GC-richキットはたくさんのメーカーで売ってますが、今PCRに使っているメーカーもしくは同じ酵素のGC-rich用を買えば良いと思います。 ＞欠失した部分のGCコンテンツは、30%ほどでしたので、GC-rich用のPCRキットの使用は考えていませんでした（手持ちになく、購入するお金ももったいないので・・・）。もし、使用するならば、どのキットがお勧めですか？また、DMSOを添加する場合、最終濃度はいかほどにすれがよいのでしょうか？ DMSOの使用で解決すれば、一番良いのですが・・・

DMSO濃度 削除/引用 No.423-6 - 2009/05/03 (日) 07:09:08 - おかめ ご助言ありがとうございます。 ＞欠失した領域の両端に同方向の反復配列か、配列が類似しているところがあったりしませんか。 欠失した部分にcacacaが3箇所ありますので、ご指摘されたようなことが起きても、おかしくないです。ありがとうございます。 ＞増幅しにくかったり、欠損が出る場合、GC-rich用のPCRキットを使えば解決できます。DMSOを加えたり、酵素を変えるの手です。切り貼りするより楽に出来ます。 欠失した部分のGCコンテンツは、30%ほどでしたので、GC-rich用のPCRキットの使用は考えていませんでした（手持ちになく、購入するお金ももったいないので・・・）。もし、使用するならば、どのキットがお勧めですか？また、DMSOを添加する場合、最終濃度はいかほどにすれがよいのでしょうか？ DMSOの使用で解決すれば、一番良いのですが・・・ 宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.423-5 - 2009/05/03 (日) 06:36:01 - PCR 増幅しにくかったり、欠損が出る場合、GC-rich用のPCRキットを使えば解決できます。 DMSOを加えたり、酵素を変えるの手です。 切り貼りするより楽に出来ます。

(無題) 削除/引用 No.423-4 - 2009/05/03 (日) 01:17:19 - AP 欠失した領域の両端に同方向の反復配列か、配列が類似しているところがあったりしませんか。そうだとすると伸長が中途半端で近位の反復配列中で停止した鎖の末端が、鋳型の遠位の反復配列にアニールして伸長してしまったのかもしれません。頻度は高くないかもしれませんが、一旦出来ると短い鎖の方が優先的に増えてしまいますので。 こういうのが、 -------==>--==>---------> <-----<==--<==---------- こうアニールして _____-------==> <-----<==--<==---------- こう ------==>----------> <-----<==---------- のように。 伸長が止まりやすい配列や反応条件によって誘発されやすい場合もあるかと思いますが、経験上、校正活性のある酵素で起こりやすんじゃないかと疑っています。一本鎖を削って短い鎖が出来やすいとか、それが変なところにアニールしても3'側のミスマッチを削って伸長してしまうとかでしょうか。

ヘアピン構造 削除/引用 No.423-3 - 2009/05/02 (土) 23:33:17 - おかめ ご回答ありがとうございます。 ＞違う酵素ですが、ヘアピンを作るような配列を含む配列を増やしたときに、「抜け」たことがありました。 私も、ヘアピン構造のため、抜けたと考え、その領域にプライマーをセットしたのですが、こちらはうまくPCRがかかりました。ヘアピンのところに、プライマーがアニールしたのでしょうか？何が起こっているのか。分かりませんが・・・ ＞変異体作成であれば、増やせるところを増やすのと、切り貼りで変異を入れられませんかね 抜けた部分を一部（制限酵素サイトあり）含む変異体を作製したので、手間がちょっとかかりますが、切り貼りでもいけます。平行して検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.423-2 - 2009/05/02 (土) 23:03:21 - ~ 違う酵素ですが、ヘアピンを作るような配列を含む配列を増やしたときに、 「抜け」たことがありました。 変異体作成であれば、増やせるところを増やすのと、切り貼りで変異を入れられませんかね。

PfuUltraで得られたPCR産物の異常 削除/引用 No.423-1 - 2009/05/02 (土) 22:20:15 - おかめ 変異体作製のため、発現ベクターに構築された3kbのターゲット遺伝子を鋳型にして、PfuUltraを用いたPCRを行っています。得られた2kbのPCR産物をサブクローニングし、配列を確認したところ、3'から100-180bpの配列が欠損していました。残りの配列に問題はありません。また、3'から100-180bpの領域にリバースプライマーを設定し、PCRを行いましたが、このPCR産物の配列は問題はありませんでした。PCR産物の塩基配列の一部が欠失した理由や解決方法について、ご意見をお願いいたします。

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