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(無題) 削除/引用 No.422-8 - 2009/05/27 (水) 00:08:14 - MK 細胞を破砕するときに目的のタンパク質が存在するフラクション（細胞膜？）を分画し、目的のタンパク質を少しでも濃縮した状態で免疫沈降を行うというのはどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.422-7 - 2009/05/25 (月) 19:07:16 - endlesslife はじめまして。免沈は抗体によって適正条件が違いますし、本当に難しい実験ですよね。僕も散々苦労しました。まず、過剰発現系で沈降したということで、抗体がworkすること、抗体量は十分であることは確かですね。しかしながら、内在性の免沈がworkしないとすると、細胞内でのAの発現量が少ないため、あとは抗体と抗原との結合力があまり強くない抗体である、ということが考えられますね。おそらく抗原量が少ないのに結合が弱い抗体なので、抗原がwash outされてしまっているのでしょう。解決策としては1)抗原量を増やす;細胞株で1X10*7~8細胞のライセートを免沈に使用する、2)wash回数を減らす、が考えられます。細胞数を増やしたくないということなので、2)でいかがでしょうか。ただしNagative control(同種のIgなど)で検出されないことが絶対条件です。それでもうまくいかないなら、過剰発現の免沈で示しても問題ないです。たしかに内在の方がいいとよくいわれますが、論文ではよくみかけますよ。僕自身はそれほど内在にこだわる意味はないと思います。頑張って下さい。

(無題) 削除/引用 No.422-6 - 2009/05/03 (日) 12:54:41 - 1234 では重複するかもな質問です。 IP効率はどの程度でしょう？ 何mgの細胞抽出液に対して何mgの抗体を加え、何mlで実験しましたか？ でIP前のサンプルと同時にIP後のsup、pptを流せばその条件下で何%のタンパク質がIPできているかわかるはずです。 この時点で例えば1%以下とかいうのであれば、IP効率低すぎな気がします。

(無題) 削除/引用 No.422-5 - 2009/05/03 (日) 12:38:54 - IRES 用いている抗体は過剰発現の免疫沈降に使用できるとのことですが 免疫沈降産物に対するウエスタンブロットで用いている抗体は免疫沈降に用いたものと同じですか？それとも過剰発現させたタンパク質にTagを付加して、そのTagに対する抗体で検出したのですか？

TK-1さんの質問は 削除/引用 No.422-4 - 2009/05/02 (土) 22:58:09 - えー Aのリン酸化状態を認識する抗リン酸化抗体を使用した場合の話かどうか？だと思いますよ。 　まず、免疫沈降の目的は何でしょうか？　細胞を潰してそのままウェスタンしたら検出できなかった→pAが少ないのか？→免疫沈降で濃縮しよう！という流れでしょうか？ 　ひとまず、失敗したとき（成功したとき）の細胞数や抽出条件(buffer, time)、ビーズの種類や量を記載してみてはいかがでしょうか。 　細胞数を増やしても、目的タンパク質の割合は一定なので（絶対量は増えるけど、不要なタンパクも同じように増えるし）、強制発現で免疫沈降したのと同じ条件では苦労するのではないかと感じています。

(無題) 削除/引用 No.422-3 - 2009/05/02 (土) 22:17:09 - 初心者 TK-1様 ＞そもそもAに対する抗体はImmunoprecipitationに使えるものなんですか。あとFACSで検出できたというのは蛋白そのものが検出できたという意味なのかリン酸化が検出できたという意味なのかはっきりしません。 記載不測失礼しました。Aに対する抗体はCOS７の強制発現細胞では免疫沈降を行うことができました。それと、Aに対する抗体はA分子をナチュラルに発現している細胞株のFACSが可能でした。ナチュラルに発現しているA分子とCOS7のトランスフェクタントでは圧倒的に発現量が違うために、細胞株では免疫沈降ができないのではと思っています。 宜しくお願いします。

http:// 削除/引用 No.422-2 - 2009/05/02 (土) 21:29:47 - TK-1 そもそもAに対する抗体はImmunoprecipitationに使えるものなんですか。あとFACSで検出できたというのは蛋白そのものが検出できたという意味なのかリン酸化が検出できたという意味なのかはっきりしません。

免疫沈降について（抗原量について） 削除/引用 No.422-1 - 2009/05/02 (土) 20:42:28 - 初心者 お世話になっております。最近、免疫沈降法を用いてある分子Aのリン酸化を検出したいと思い、実験系をいくつか立ち上げました。 その分子Aは様々な細胞株に発現していて、FACSではしっかり検出可能でした。しかし、その細胞株をAに対する抗体で免疫沈降してもAは検出できませんでした（NP４０でもtriton使用時でも）。 次に分子AのcDNAをCOS7に強制発現させ、上記と同様の免疫沈降を行うと分子Aを検出することができました。 できるだけnatural抗原を検出したほうが良いと思っていて、強制発現系ではなく細胞株で行いたいのですが、細胞数を増やす以外に何か良い方法はないでしょうか？ 宜しくお願いします。

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