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(無題) 削除/引用 No.420-10 - 2009/05/02 (土) 09:21:41 - qq 3-cm dish程度であれば、沈殿に100-200ulの2x　サンプルバッファー（SDS-PAGEの試料調整用のやつね）を直接添加し、ネチョネチョになるようであれば、超音波処理です。いずれにしても、分化したC2C12なら、ミオシンとアクチンはCBBで見えるはずですよね。細胞抽出が全然うまくいっていないのかなと、思ったのです。悩むようなら、細胞の生えているディッシュをPBSで2回濯いで、サンプフバッファーを直撃するのもあってもいいですよね。

(無題) 削除/引用 No.420-9 - 2009/05/02 (土) 06:06:32 - おお あ、そうそう12%PAGEは高すぎると思いますよわたしも。 わたしなら6%たかくても7.5%にすると思います。あとは グラジエントをつかうとか。

(無題) 削除/引用 No.420-8 - 2009/05/02 (土) 06:03:47 - おお しっかり分化した状態ならMHCは非常に大量に存在しますので、 抽出がしっかりされていたなら、200kDaあたりにクリアーに CBBでバンドがみえます。希釈していって一番薄い濃度 で検出できるタンパクとも言えるのではないかとおもいます。 したがって、200kDaのバンドをCBBでそめてインターナル コントロールとして出しているデーターも見かけます。 ですので、抽出条件が悪いのか分化がうまくいってないのか どちらかが原因と思います。抽出条件については今まで可也の 研究が発表されていますので１度調べるといいかと思います。 思いつくのは1%TRITON X-100(OR NP-40) in PBSとかRIPA バッファー でしょうか。きん組織は可也構造がしっかりした大きな高次構造を取るので、 普通の細胞より溶解しにくいのは確かです。 分化に関しては細胞が融合して、長い管のようなものが できていればまず問題ないと思います。 もし典型的な分化の条件で実験していないのなら、典型的な 分化の条件で、形態のしっかりしたものをポジコンにとるとか、 マウスからきん組織を用意するとかできるかと思います。 たしかC2C12は血清濃度をさげると分化しましたよね。 細胞を免疫染色する事は考えてないのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.420-7 - 2009/05/02 (土) 03:16:21 - 名無し ミオシン壊れやすいです。ふつうの大きさの蛋白質ならちょっとくらい壊れても分子量はあまり変わらないこともあるけど、ミオシンは分子が大きいですから１ヶ所切れてもとくに真ん中あたりだと分子量はすごい変わる事あるとおもいます。WBどうですか。下の方に変な感じでいくつかバンド出ませんかそれかスメアになるとかないですか。分解おさえるような条件でやっても、マスとかやると低分子量のあたりにHMの断片がよく出てきます。何か市販の特定のlysis bufferを使うべき特別な理由があれば別ですが、単に細胞とかしてとりあえず中の蛋白質全部見てみたいというだけならば、SDS-sample bufferで溶かしてソニケーションして電気泳動するというのはダメですか。そんなに木を使わなくても変な分解はかなり抑えられるし、もしか可溶化いけてないかも、とかの心配もあまりなくなるしということで、うちらの仲間内ではいつもそうしてますが。

Lysis buffer 削除/引用 No.420-6 - 2009/05/02 (土) 02:01:53 - TS >その結果，PonceauS染色で転写後のメンブレン，転写後のゲルともに200kDa付近の染色が確認できませんでしたので，やはり目的とするタンパクが抽出できていないのでしょうか（または結合の切断などが上手くできておらず，アプライ穴から流れていない？！）？ 絶対の自信はありませんが、現状における打開策としては、200kDa付近のタンパク質をなんとかメンブレンに乗せることのような気がします。 分化の話も出ており、それも重要かとは思いますがいますが、MLCは（おそらく）すべての細胞に発現するタンパク質ですから、分化してなくても検出できるはずです。（神経細胞は専門外ですので、実際には使用したことはありませんが） タンパク質が、ゲルにもメンブレンにも染色されないということは、抽出段階で、ロスしていると考えるのが妥当かもしれないですね。ただ、マイルドな抽出条件でも抽出される高分子タンパク質もあると思いますから、若干腑に落ちませんが。 Lysis bufferですが、私は簡便に総タンパク質を抽出したいときには、0.3% SDS in 10 mM Tris, pH 7.4を使用しています。 かなりシンプルなBufferですが、このBufferでは、核膜もLyseされますので、抽出液がどろりとします。溶出液をマイクロチューブに移し、4分間、煮沸した後、超音波でGenomeを切断し、タンパク質測定、サンプルバッファーとの混和、という感じで、進めています。 いずれにしても、遠心などによるタンパク質をロスをすることなしに、サンプルバッファーに混和することが大切かと思います。新鮮なサンプルバッファーを使って、変な可能性を払拭しておくという手もあるかもしれませんね。

ゲル濃度について 削除/引用 No.420-5 - 2009/05/02 (土) 01:09:56 - C2C12 TS 様，ご教授ありがとうございます！！ >PonceauS染色で転写後のメンブレン、CBBで転写後のゲルをそれぞれ染めてみて、200kDa付近のの転写がきちんと行われているか確認してはどうでしょうか？ はい，本日，CBB で転写後のゲル染色を実施いたしました． その結果，PonceauS染色で転写後のメンブレン，転写後のゲルともに200kDa付近の染色が確認できませんでしたので，やはり目的とするタンパクが抽出できていないのでしょうか（または結合の切断などが上手くできておらず，アプライ穴から流れていない？！）？ >またゲル濃度は、6%程度が良いような気もしますけど。 はい，次回，7.5％のゲルを用いて実施してみようと考えておりました． 6％も Try してみます！ >市販のキットで、タンパク質を抽出しているようですが、超音波処理後の遠心を省略してみてはどうでしょう？ こちらも Try してみます！ >当該キットの組成を少し見ましたが、かなりマイルドな組成ですね。超音波処理をしても、遠心後、細胞骨格系のタンパク質の一部は沈殿してしまっているのではないでしょうか？ >あるいは、もう少し強力なLysis bufferを使うか、直接サンプルバッファーに溶解するのもありかと思います。 了解いたしました．沈殿物を-80℃保存していますので，電気泳動してみます！ もしお奨めの強力な Lysis buffer がございましたら，ご教授くださると幸いです． よろしくお願い申し上げます．

C2C12 の分化について 削除/引用 No.420-4 - 2009/05/02 (土) 00:53:21 - C2C12 qq 様，ご教授ありがとうございます！ >ついでですから、沈殿も電気泳動に流してみては如何がでしょうか。 はい，了解しました．Try してみます． ちなみに，沈殿物を電気泳動する場合ですと，溶解用の Buffer は何を使用するとよろしいでしょうか？ >見た目で、分化は充分行っていますよね？ はい，分化はきちんと進んでいると思います．

２点ほど気になります 削除/引用 No.420-3 - 2009/05/01 (金) 22:41:59 - TS 抗体のことは疑わないとして、それ以外に２点ほど気になる点があります。 12.5%のゲルは、200kDaのタンパク質には濃度が高すぎませんか？ PonceauS染色で転写後のメンブレン、CBBで転写後のゲルをそれぞれ染めてみて、200kDa付近のの転写がきちんと行われているか確認してはどうでしょうか？ またゲル濃度は、6%程度が良いような気もしますけど。 市販のキットで、タンパク質を抽出しているようですが、超音波処理後の遠心を省略してみてはどうでしょう？ 当該キットの組成を少し見ましたが、かなりマイルドな組成ですね。超音波処理をしても、遠心後、細胞骨格系のタンパク質の一部は沈殿してしまっているのではないでしょうか？ あるいは、もう少し強力なLysis bufferを使うか、直接サンプルバッファーに溶解するのもありかと思います。

(無題) 削除/引用 No.420-2 - 2009/05/01 (金) 20:06:58 - qq >サンプルの調整は、Sigma の CelLytic M Cell Lysis Reagent を使用して細胞を回収後、 >超音波破砕、遠心して上清を得ております。 ついでですから、沈殿も電気泳動に流してみては如何がでしょうか。 見た目で、分化は充分行っていますよね？

Myosin heavy chain の検出について 削除/引用 No.420-1 - 2009/05/01 (金) 18:39:11 - C2C12 とても初歩的なことで申し訳ありません。 western blot で 筋管細胞（C2C12 myotube）の myosin heavy chain (fast および slow)を検出しようとしているのですが、目的のバンドが出ません。 諸先生方の論文を検索すると、本細胞でmyosin heavy chain が発現していますので検出できないはずはないと思うのですが、初心者なものでどこに原因があるかよくわかりません。 サンプルの調整は、Sigma の CelLytic M Cell Lysis Reagent を使用して細胞を回収後、超音波破砕、遠心して上清を得ております。 使用している抗体は Sigma 社の MY32 と NOQ7.5.4D です。 CBB で SDS-PAGE 後のゲルを染色しましても、数箇所バンドが確認できるだけで目的のバンド（200 kDa）はみられません。 ゲル濃度が12.5％のものを使用しており、アプライしたサンプルが上手く流いない？ことが原因なのでしょうか？ SDS 濃度、熱処理時間の変更や、2-メルカプトエタノール、DTT の使用変更などを試みているのですが改善がみられず、どうすればよいかわかりません。 どなたかわかる方がいらっしゃいましたら教えてください。 よろしくお願いいたします。

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