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(無題) 削除/引用 No.42-14 - 2009/02/19 (木) 20:02:38 - ザンギ ＃スレッドが完全に乗っ取られてる（苦笑） イントロンジャンクションを挟んでるプライマーセットでLCMサンプルからのPCRプロダクトの配列を確認してるんだったら、リバイスの時にそう回答すればよかったのに。 サイクル数については、30サイクルでは無いというには少ないし、35サイクルでは有るというには多いということですよね？

(無題) 削除/引用 No.42-13 - 2009/02/19 (木) 19:04:52 - たく みなさまありがとうございます。 一応シークエンスは行い、完全に一致しておりました。 またLCMサンプルですのでどうしても35サイクル位回したくなりますが、35で多いのであれば、通常論文のRT=PCRのサイクルはどれくらいが普通なのでしょうか？以前30サイクルでしたところ（腎で発現し、脳で発現していないもの）、レビューアーに発現が見られないのはサイクル数が少ないためではないのかといわれ、それ以来35でしていたもので

(無題) 削除/引用 No.42-12 - 2009/02/19 (木) 15:22:22 - ザンギ ３５サイクルは多いですね。 鋳型が1コピーでこれくらいのサイクル数になるのですが、非特異的な増幅と区別がつけられないと思います。 ＰＣＲ産物と思われるバンドのＤＮＡ断片が、特異的に増幅した目的のものであることを示す必要があるでしょうね。

たくさま 削除/引用 No.42-11 - 2009/02/19 (木) 14:32:33 - かよ ＬＣＭの結果を組織全体の結果と比べること自体はあまり意味がありませんから、たくさんのおっしゃるとおりです。しかし微量なものをリアルタイムでやっても正確ではない、というのは必ずしも正しくありません。わたしの先の投稿にあるように、微量でも定量できることを確認してさえおけばよいのです。それに、ＬＣＭサンプルは余分な細胞の混入がないためにターゲット遺伝子の発現がかえって明確に示せることもありますね。どうしてもバンドが薄ければ、ＲＮＡを増幅するという手もあるでしょうし、ＰＣＲ産物をシーケンスして正しいものだと示す手もあるかもしれません。もともとのＬＣＭ量を増やすという手もあります。一枚の切片に採取する細胞が少ないのでしたらスライドを何枚も使えば量は増やせますし、検討すべき方法はいくつかあるのではないでしょうか。。

(無題) 削除/引用 No.42-10 - 2009/02/18 (水) 23:25:22 - たく ありがとうございます。 一応RI-のネガコンでバンドが出ないことと、免疫染色もつけてだしたのですが。またGAPDHもポジコンと比較して弱いことも示して、薄いバンドしか出ないことの正当性を書いてはいたのですが。 アプライ量を増やしたりして濃いバンドにしたほうがよかったのでしょうか？サイクルは35サイクルですがそれでもポジコンのほうがプラトーになっているのでサイクルが多いとすら言われました。

(無題) 削除/引用 No.42-9 - 2009/02/18 (水) 13:00:44 - R たく様 本当に目的の発現が確認されたといっていいのかどうか疑わしいので、 レフェリーは追加実験を指示したと思われます。 レフェリーは、確証が得られなかったので、 その発現は観察されなかったと判断したのでしょう。 (アーティファクトな結果である) リジェクトされても仕方ないかも。

(無題) 削除/引用 No.42-8 - 2009/02/18 (水) 12:18:31 - たく 便乗の質問です。 私もLCMでサンプルをとって発現を確認しています。おもにRT-PCRでゲル上での発現の有無を確認しているのですが、ある雑誌に投稿した際に、 LCMでの微量サンプル（組織）で目的のRNAの発現が確認されたと書いて出したら、ポジコンの組織との発現量の比較が絶対に必要とかかれリバイスがかえってきました。 LCMのサンプルで発現量も少ないのでバンド自体がtraceくらいしか出てないので実際にWORKしているものなのかきちんと示せ、という内容でした。 ポジコンはLCMで採取したものでもなく、臓器間の定量比較自体が目的ではなく、微量サンプルでのリアルタイムをしても正確ではないと考える、と書いて追加実験なしで戻したらリジェクトされました。 この場合こちらに非があったと考えるのでしょうか？

予備実験を 削除/引用 No.42-7 - 2009/02/18 (水) 10:01:40 - かよ 私はＬＣＭサンプルを扱うため、普段ＲＮＡの濃度は測定しません（できません）。しかし、ＲＮＡの量があまりにも少ないと、遺伝子によってはリアルタイムＰＣＲでもきちんと定量＆補正できないことがあるので、あらかじめ以下のことを確認しておきます。 濃度のわかっているＲＮＡからcDNAを合成し、ピコグラムオーダー程度まで段階希釈します。それを用いてターゲットと内部コントロールのＰＣＲをかけます。その結果を見て、濃度がどの程度までぶれても内部コントロールで補正できるかどうかを確認します。私の場合だと、ＬＣＭではなくてマクロの組織から抽出したＲＮＡなどを用いてあらかじめこの予備実験をプライマーごとに行っています。 もともと発現の少ない遺伝子だと、ピコのオーダーではつらいです。それから、おおざっぱにいって、内部コントロールが一桁違うと（たとえば100ngと１ug)ちょっとどうかなという気持ちにはなりますね。 あと、私の場合はＬＣＭで採取する細胞数をそろえておけば、だいたい内部コントロールの値はそろいます。

(無題) 削除/引用 No.42-6 - 2009/02/18 (水) 02:51:42 - おお プロメガにポリA-RNAの量を見積もるキットがあります。 ルシフェラーゼを使う系でたしかかなり感度がよかった と思います。mRNAの量であればこれを使えるのではと おもいました。一度カタログなどでご確認ください。

(無題) 削除/引用 No.42-5 - 2009/02/18 (水) 00:02:13 - qq ところで、1ug程度しか取れていないとなると、RNA定量はUV測定ということですか？ そうだとすると、「UV測定でRNAを定量できる」という前提が成立する程度に、RNAが取れていて、その上、RNA以外のUV吸収が除去できていると考えて宜しいのでしょうか？ そんな話とは別に、取った試料の定量（のごときもの）は可能な範囲内でやっておきたいものです。使い捨ての定量なら、1/5程度を使っても、その後の結果に影響しないと思いますが如何でしょうか。その程度の量が測定感度範囲内であれば、やっても損はないと思いますね。

Re: 削除/引用 No.42-4 - 2009/02/17 (火) 19:46:25 - UC こんにちは。予め、「サンプル間のRNAの量のぶれはたかがしれている」とか「house keeping geneがそんなにぶれない」と分かっていれば、問題ないと思いますよ。そもそも、RNA定量と言っても、なるべく正確に測ろうと思えば、測定の段階でduplicate、triplicateすることになると思いますが、微量サンプル相手にそれは不可能ですし、仮にRNA量を正確に揃えたとしても、cDNA合成の段階で、効率の誤差も生じるでしょうし、そのためのhouse keeping gene補正な訳です。 　実際に、以前、微量サンプルで、RNA定量チェックしてからRNAを揃えてqPCRをした場合と、そうせずにqPCRをした場合を比較してみましたが、相違ないという結論に達しました(あくまでも系によりますよ)。 　個人的には、RNA定量よりも、如何に質の良いRNAを回収するかという方が大事だと思っています。

(無題) 削除/引用 No.42-3 - 2009/02/17 (火) 18:27:08 - ザンギ 測れないものはしょうがないですね。 できればアジレントなんかでRNAの品質はチェックするほうがいいです。 time courseが数分の範囲内であれば、問題ないかもしれません。 数十分も時間幅があるなら、トータルRNA量よりもhouse keeping geneが 変動するかもと思っておくほうが安全でしょうね。 複数のhouse keeping geneを測定するのが安心かも。 実験前後の細胞数を数えておくと参考データにはなるかもしれませんね。

RNAの定量は必要でしょうか？ 削除/引用 No.42-1 - 2009/02/17 (火) 17:00:04 - RNA初心者 お世話になります。 現在、微量サンプルからRNAを回収し、それを逆転写したのち、qPCRを行っています。data解析にはhouse keeping geneで補正をしたものを出しております。 今回みなさまのご意見をいただきたいのは、微量サンプルのためRT前のRNAの定量を行っていないという点です。 回収されるRNAは1 ugも採れません。 そのため、定量せずRTを直接行っていうのですが。 house keeping geneで補正しているから定量しなくても全く問題ないだろうと考えています。 もちろんhouse keepingだからといって全く動かない遺伝子というわけではないこともわかっています。 サンプルというのは微量の細胞を薬剤で刺激したのちのtime courseをとっていますので、サンプル間のRNAの量のぶれはたかがしれていると思っています。 それでもみなさまは、やはり定量すべきであるとお考えでしょうか？ どうかご教示ください。

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