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出ました！ 削除/引用 No.412-9 - 2009/05/13 (水) 14:52:39 - ii-Yeast 名無しさん、おおさん いろいろと有り難うございました。 NoOH処理で、検出することができました。 いろいろと教えて頂きありがとうございました。 また、書き込みをすることがあるかと思いますが、その際にはどうぞよろしくお願いします。

ありがとうございました　3。 削除/引用 No.412-8 - 2009/05/09 (土) 12:57:03 - ii-Yeast 名無しさん 参考資料を有り難うございました。 この方法を使えば、DNA抽出の効率も上がりそう　と思いました。 今はザイモリエースを使って細胞壁を溶かしているのですが、今ひとつ回収率に満足していないので、これはいけるかもと思いました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.412-7 - 2009/05/08 (金) 08:26:40 - 名無し 酵母からの蛋白質の抽出方法についてはこの論文でも検討されています。http://www.jstage.jst.go.jp/article/bbb/70/8/70_1992/_article

ありがとうございました　2。 削除/引用 No.412-6 - 2009/05/07 (木) 23:18:11 - ii-Yeast 名無しさん そうなのですね。Sample Buffer で可溶化しない物はほとんどない　と聞いていたのですが、酵母は違うのですね。 NaOHが細胞壁を壊すことも勉強になりました。 有り難うございました。

(無題) 削除/引用 No.412-5 - 2009/05/04 (月) 12:56:39 - 名無し NaOHは、酵母の細胞壁を構成する複合糖質の構造を壊すらしいです。そう聞きました。培養細胞と違い、酵母は単にSDS-sample bufferでやっただけでは蛋白質はあまり抽出できないのだそうです。

有り難うございます。 削除/引用 No.412-4 - 2009/05/01 (金) 20:43:56 - ii-Yeast 名無しさん、おおさん 早速のご返信を有り難うございました。 私の周りに酵母をいじっている人がいないので、酵母の実験法のスタンダードが解らす、助かります。 名無しさん NaOH処理ですね。知りませんでした。 タンパク実験をあまりやったことがないので、Y-PERとNaOHによる可溶化加減を知らなかったのですが、NaOHの方が強力なのですね。 酵母に0.2NNaOH をいれて、室温5分、その後サンプルバッファーに溶解 でいいのでしょうか？ おおさん 説明が不足していてすみません。 Y-PER →そのままサンプルバッファー　では検出できませんでした。 Y-PER→ペレットサンプルバッファー　をやってみます。 そうですね。 タグからの発現が上手くいっているポジコンをつくるとはっきりしますね。 ウエスタンのポジコンは、HAタグにはマルチプルタグマーカーを FLAGには、他の方が哺乳類の培養細胞に、他の遺伝子をFLAG付きで発現させたサンプルを使いました。

(無題) 削除/引用 No.412-3 - 2009/05/01 (金) 12:24:59 - おお >[Re:2] 名無しさんは書きました : > 酵母の研究してる人がよくやってるNaOH処理してからSDS-sample bufferで溶解という方法ではどうでしょうか。Y-PERは比較的マイルドなlysis bufferですから可溶化されるのは細胞質の可溶性蛋白質が主体ではないかと思うのですが。たとえばクロマチンを構成するような核蛋白質などは難しいのではないでしょうか。 Y-PERがマイルドということなので、Y-PER処理後遠心しないで 直接サンプルバッファーを加えるか、Y-PER処理後、遠心 したペレットにサンプルバッファーを加えSDSPAGEすれば いいかなっと。 そのタグのあとに、GFPなどをつなげるなどすると、作った プラスミドのタグの頭にあるMを開始コドンとして読んで いることが検討しやすいのではないでしょうか、、、 ポジコント仰ってますが何を使っているのでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.412-2 - 2009/05/01 (金) 05:36:04 - 名無し 酵母の研究してる人がよくやってるNaOH処理してからSDS-sample bufferで溶解という方法ではどうでしょうか。Y-PERは比較的マイルドなlysis bufferですから可溶化されるのは細胞質の可溶性蛋白質が主体ではないかと思うのですが。たとえばクロマチンを構成するような核蛋白質などは難しいのではないでしょうか。

yeast western 削除/引用 No.412-1 - 2009/04/30 (木) 22:31:59 - iiYeast2 GAL1 もしくはCUP1プロモーターに、taqをつけてPOL1を発現させたのですが、ウエスタンで検出できません。タグの上流にATGを付け、その上流3bpにはAをおきました。 誘導は GAL1の方は、2％グルコースで培養後、2％ガラクトースに変えて２4時間おこないました。 CUP１の方は　酵母を増やした後に、Cuを0.1から0.001mMまで濃度をふって24時間おこないました。 抗体はFLAGはポリクロをHAはモノクロを使っており、ウェスタン用のポジコンは上手くいっています。 POL1は約170kDaと大きいので、8%のゲルを使っています。 Y-PERで処理をしてサンプルバッファーに溶かしています。 何がいけないのでしょうか。どなたか教えていただけませんでしょうか。

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