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ありがとうございました 削除/引用 No.407-6 - 2009/05/07 (木) 08:04:51 - edu Pumpkin 様 nested PCR の時、多少内側に設定するので、なんとなくそう思っていましたが、まあ、今回は、最初は逆転写であり、PCR じゃないから、ともかく、同一primer で行います（GWで本実験をさぼってしまったのでこれから行います）。

(無題) 削除/引用 No.407-5 - 2009/04/30 (木) 18:43:47 - Pumpkin >逆転写反応の時に使用するgene-specific primerと、その後のPCR増幅の時のreverse primerを同一のものにして良い それで良いと思います。例えば、one-stepのqPCRのときは2つのプライマーと鋳型RNAから反応を始めますよね？クローニングでも同じですよ。 >少しずらした方が良いと思い込んでいたため、びっくりしました 何故、ずらした方が良いと思われたのでしょうか？Gene specificなのですよね？PCRするときに内側に設計し直したプライマーでやっても良いですが、Gene spesificなプライマーから伸長されたcDNAを鋳型にするわけですか、このプライマーはそのままでFowardを追加すればデザインしたPCR産物が得られるはずですよね。

ありがとうございました 削除/引用 No.407-4 - 2009/04/30 (木) 17:49:15 - edu Pumpkin様 逆転写反応の時に使用するgene-specific primerと、その後のPCR増幅の時のreverse primerを同一のものにして良い、ということかと了解致しました。なんとなく、少しずらした方が良いと思い込んでいたため、びっくりしましたが、こんな感じでokと分かってよかったです。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.407-3 - 2009/04/30 (木) 15:24:25 - Pumpkin あとで、対になるようなプライマーでPCRをかけたりされるのであれば、そのtemplateのantisence(reverse)なプライマーを使えばいいと思います（そのときにヘアピンを作らないとか色々検討されていますよね）。

逆転写反応時のGSPの作り方 削除/引用 No.407-1 - 2009/04/30 (木) 12:02:22 - edu total RNAを用いた逆転写反応の時に使用するgene-specific primerの作り方ですが、annealing temperatureや長さ等、ある程度何か気をつけた方が良い点はあるのでしょうか？42度Cで反応させる事を考えれば、50度C以上程度であれば、ヘアピンとかdimerとかに注意すれば、後はけっこう適当でもいいような感じですが、どうなんでしょうか？いざ作ろうとして、なかなか適当なマニュアルが見つけられず、躊躇しております。御教授下さい。

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