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(無題) 削除/引用 No.406-13 - 2009/05/15 (金) 09:24:34 - 手抜き > サイズマーカーで 30bpの場所を推定するんですか？ 今回はたまたま用いたプラスミドがマニュアルで取った物だったので、混入している RNA 分解産物がぼんやりと見えているあたりを抜きました。もちろん短鎖のマーカーがあればそれでも結構ですし、余っているオリゴ等を流してもいいかもしれません。0.8%くらいのゲルでは、100bp 以下の短いサイズはほとんど分画されないので、細かなサイズの違いや一本鎖二本鎖の違いなどは考慮しません。泳動先端の目安です。気になるようなら、ゲルを太めに抜くか、何本かに分けて抜けばいいと思います。 > ゲル片の上清とはなんでしょうか？ ゲルをエッペンに入れて軽く遠心し、表面に染み出してくる液のことです。一度 freeze-thaw すれば回収しやすくなります。フィルター付きカップなどで濾過すれば、より回収量は増えますが、通常のライゲーションには 0.5ul しか使わないので、そこまでやる事は稀です。 > 今までしたことないですが、そういうやりかたは一般的なんですか？ 一般的かどうかは知りませんが、私たちのグループでは皆これでやっていて、問題なく動いています。

(無題) 削除/引用 No.406-12 - 2009/05/15 (金) 06:58:20 - 苦労人 >端から端までぴったり二重鎖になるように設計して、末端を制限酵素で切って付着末端を作るより、あらかじめ両端に付着末端になる一本鎖がはみ出すように設計する方が賢いです。 アドバイスありがとうございます。もうしばらく、プラスミドでねばって無理ならオリゴを試します。 >ベクターは脱リン酸化して、双方を通常の 0.8% アガロースゲルで泳動 当然 30bp のバンドは見えないが、泳動先端付近を適当に切り抜く バンドが見えないのに切り出して入るもんなんですね。 サイズマーカーで 30bpの場所を推定するんですか？ >ゲル片の上清を等量混ぜてライゲーション という手順でした。 ゲル片の上清とはなんでしょうか？ 今までしたことないですが、そういうやりかたは一般的なんですか？

(無題) 削除/引用 No.406-11 - 2009/05/14 (木) 10:46:18 - 手抜き 先日 30bp のフラグメントをサブクローンしましたが、特に困難はなかったですよ。 ベクター、インサートとも 0.5ug 程度を切断 ベクターは脱リン酸化して、双方を通常の 0.8% アガロースゲルで泳動 当然 30bp のバンドは見えないが、泳動先端付近を適当に切り抜く ゲル片の上清を等量混ぜてライゲーション という手順でした。 もちろんオリゴを合成しても結構ですが、手元にプラスミドがあるなら、私なら普通にサブクローンします。 ご参考まで。

(無題) 削除/引用 No.406-10 - 2009/05/14 (木) 10:10:56 - AP >アドバイスありがとうございます。まだ解決できてません。やはりオリゴのほうが簡単なんしょうか。オリゴを注文するときは、オリゴの断端が制限酵素の切れ端と一致しておくようにするのでしょうか？ 端から端までぴったり二重鎖になるように設計して、末端を制限酵素で切って付着末端を作るより、あらかじめ両端に付着末端になる一本鎖がはみ出すように設計する方が賢いです。合成オリゴでligation adaptorアダプターを作るのも同じことですね。

(無題) 削除/引用 No.406-9 - 2009/05/14 (木) 07:57:33 - 苦労人 >既に遅いかもしれませんが何度も30mer程度のDNAをベクターに ライゲーションしたことがあります。私の場合、センス、 アンチセンスのDNA合成を注文してそれをコンストラクション しています。 アドバイスありがとうございます。まだ解決できてません。やはりオリゴのほうが簡単なんしょうか。オリゴを注文するときは、オリゴの断端が制限酵素の切れ端と一致しておくようにするのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.406-8 - 2009/05/14 (木) 07:51:19 - 苦労人 遅くなりましたが、コメントありがとうございます。 プラスミドから60ｂｐを切り出そうとしたのですが、 おおさんのご指摘通り、重量ベースの終了が低すぎて、 ゲル状でバンドを確認することができません。 3.5kbのプラスミドなんですが、大量（10ugくらい?）の プラスミドを切断しないと60bpのバンドは見えないのでしょうか？ 何かいい方法があれば教えていただきたいです。 >もし効率よく60bpを得るためにタンデムにつながった物を作るという こともあるかと思います。 タンデムにつながった物を作るというのは、簡単にできるのでしょうか？ 具体的な方法教えていただけると嬉しいです。

(無題) 削除/引用 No.406-7 - 2009/05/05 (火) 19:07:49 - A 既に遅いかもしれませんが何度も30mer程度のDNAをベクターに ライゲーションしたことがあります。私の場合、センス、 アンチセンスのDNA合成を注文してそれをコンストラクション しています。 1.100uMのDNAを20uLを1:1で混ぜて,PCRマシンでアニール（99度で15minの後ゆっくり4度に戻す） 2.アニールした溶液の5uLをリン酸化してエタ沈(沈殿が何とか見える程度)、回収(200uLのDDW) 3.ベクターとライゲーション ラーゲーションインサートの定量ができないのでいくつか条件を振る必要があると思います。 経験的にはインサートの量をかなり少なくしないと当たりのクローンが出てきません。 回収した溶液を1-200倍ぐらいの範囲で希釈してライゲーションあたり1uL使ってみてください。 ベクター側の脱燐酸を行わないほうが良い結果が得られることが多いようです。

(無題) 削除/引用 No.406-6 - 2009/04/29 (水) 11:07:22 - AP あんまりスマートな方法のように思えないのですが。DNAに欠失をつくるならそうなるようにプライマーを合成してPCRでやりたいところですが、PCRでインサートを調製するのは避けるという方針なんですね。 60塩基くらいなら全長の合成をオーダーしてしまったほうがいいでしょう。現在の技術ならどこに頼んでも普通にできる範囲です。ただし長くなるほど合成エラーが増え、そのぶん合成や精製のグレードを高くしなければならないので、価格は高くなるし、最終産物の配列の確認は必要になると思います。 わたしなら、一対の合成DNAをアニールしたとき、末端に異なる付着末端が生じるようにデザインし、加熱、徐冷でアニールさせたものを、対応する制限酵素で二重切断したベクターに過剰量加えてligationしてトランスフォーメーションします。リン酸化していないインサート同士はligationして重合することはなく、脱リン酸化していない二重消化ベクターが環状化するのはインサートが一つだけ入ったやつだけ、というところを狙います。 あるいは、全長を合成するのではなく、末端の一部のみが対合する25-35 ntくらいの短い一本鎖DNA、2本か4本をまぜて(下の----の部分）、一本鎖のままのところ(....の部分）はklenowかPol Iで伸長させて全長の二本鎖を得ます。 ------....------.... ....-------....----- で、末端を制限酵素処理してベクターにligation。 この場合は、制限酵素処理によって末端のリン酸基が生じて、インサート同士がligationしてタンデムになる可能性があるので、ベクターインサート比を工夫する（ベクター過剰気味にする）か、インサートを脱リン酸化するといいのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.406-4 - 2009/04/29 (水) 07:58:08 - おお >[Re:1] 苦労人さんは書きました : > ある遺伝子の全長から3'UTRを取り除くために、ちいさなフラグメントをライゲーションすることになりました。ユニークな制限酵素の場所がいい場所にないので、60bpのインサートをライゲーションしないといけないのですが、可能でしょうか？ > PCRで増やしてベクターに乗せてシークエンスを読んでから、制限酵素で処理した後電気泳動し、60bpのフラグメントをゲル状で切り出そうと思ってます。100以下の大きさのインサートをライゲーションしたことがないので、特に注意することあればご教授願いたく思います。 60bpなら何ら普通のやり方でライゲーションできると思います。 しかしながら、お示しになった文からどのような手順で何をえるのか よく分かりません。 合成のオリゴを使うとPCRをする必要ははしかにありません。 両方のストランドを等モルでまぜて、90度ぐらいのヒートブロック にチューブをいれて、ヒートブロックのスイッチをきり室温に 下がるまで待つとか、500ー1000mlの沸かしたお湯にチューブを つけ室温に下がるまで放置するとかでアニーリングさせたりします。 ゆっくり温度を下げるのがコツです。 あとはライゲーションして入ったプラスミドにはそれなりにタンデムに つながったものが交じっているかもしれません。そのへんを見分けるように した方がいいかと思います。 逆にプラスミドから60bpを切り出すと重量ベースの収量が非常に低いので もし効率よく60bpを得るためにタンデムにつながった物を作るという こともあるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.406-3 - 2009/04/29 (水) 07:16:13 - 苦労人 >60bpならPCRしないで制限酵素サイトができるように全合成して アニールさせてから，ベクターとライゲーションしたらどうでしょう． 普通にプライマーを注文するように、60bpのsenseとASのオリゴを注文して合成すればいいのでしょうか？そこからアニールするのは、何か特別な処理がいりますか？ >QuikChangeで入れてしまうか． QuikChangeとは何でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.406-2 - 2009/04/29 (水) 06:39:39 - xtal 60bpならPCRしないで制限酵素サイトができるように全合成して アニールさせてから，ベクターとライゲーションしたらどうでしょう． もしくは，QuikChangeで入れてしまうか．60bpぐらいなら入るはずです．

短いフラグメントのライゲーション 削除/引用 No.406-1 - 2009/04/29 (水) 06:20:57 - 苦労人 ある遺伝子の全長から3'UTRを取り除くために、ちいさなフラグメントをライゲーションすることになりました。ユニークな制限酵素の場所がいい場所にないので、60bpのインサートをライゲーションしないといけないのですが、可能でしょうか？ PCRで増やしてベクターに乗せてシークエンスを読んでから、制限酵素で処理した後電気泳動し、60bpのフラグメントをゲル状で切り出そうと思ってます。100以下の大きさのインサートをライゲーションしたことがないので、特に注意することあればご教授願いたく思います。

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