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(無題) 削除/引用 No.397-15 - 2009/05/19 (火) 20:32:09 - ノンスペ みなさまに教えていただいた方法でいろいろ試してみた結果、 ノンスペを最小限に抑えて、クリアなバンドを検出することができました。 やはりサンプルバッファー含め、サンプル調整に問題があったようです。 名無しさん、おおさん、APさん、たろうさん、本当にありがとうございました！！

(無題) 削除/引用 No.397-13 - 2009/04/28 (火) 21:23:33 - おお >[Re:11] APさんは書きました : > >現在はサンプルバッファーを加えた状態で 2 mg/ml になっています。濃いですね・・・。Lysisで希釈して調整しなおすというので問題ありませんでしょうか > > めちゃくちゃ濃いわけでもないとおもいますが、乗せすぎの可能性はあります。 >[Re:10] ノンスペさんは書きました : > おおさん > > 現在はサンプルバッファーを加えた状態で 2 mg/ml になっています。濃いですね・・・。Lysisで希釈して調整しなおすというので問題ありませんでしょうか？ APさんと全く同じいけんです。2mg/mlはすごい濃すぎるとは思えないのですが、 少なめに流した方がよさそうだったことも手伝って示した濃度を考えました。 感覚的には5ug/laneくらいでも十分そうな気がします。いがいと少なめのほうが バンドがシャープになって検出感度が出ることもあるので私は少なめに流すことが おおいです。

(無題) 削除/引用 No.397-12 - 2009/04/28 (火) 21:03:57 - ノンスペ APさん アドバイスありがとうございます。 早速明日から試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.397-11 - 2009/04/28 (火) 16:10:45 - AP >現在はサンプルバッファーを加えた状態で 2 mg/ml になっています。濃いですね・・・。Lysisで希釈して調整しなおすというので問題ありませんでしょうか めちゃくちゃ濃いわけでもないとおもいますが、乗せすぎの可能性はあります。 高分子にどばっと見えているのも、ノンスペでなくて正規の標的タンパク質がオーバーロードでアグっている、分離し切れていないだけかもしれません。どばっと見えているくらいだから、シグナル強度・検出感度は高いようですので、ぐっとタンパク質ロード量を減らすときれいに分離できるかも知れません。サンプル濃度の調節、体積の調節は1x sample bufferで希釈すればいいでしょう。 > 注射針は21Gで大丈夫でしょうか？また、注射針を通したあと、再度遠心は必要でしょうか？アドバイスいただけると幸いです。 21 Gなら十分に細くて良いと思います（たぶん18 Gくらいでもいけると思いますが）。泡立つと面倒なので、sample bufferを加える前のlysateでやるのがいいと思いますが、sample bufferに懸濁した物でも乱暴にしなければいけます。DNAだけでなくほかの夾雑物の粒子があるかもしれませんから、何にしても遠心はしておいた方がいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.397-10 - 2009/04/28 (火) 11:20:31 - ノンスペ おおさん 現在はサンプルバッファーを加えた状態で 2 mg/ml になっています。濃いですね・・・。Lysisで希釈して調整しなおすというので問題ありませんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.397-9 - 2009/04/28 (火) 03:28:47 - おお マーカーはきれいに流れているけど、サンプルがイマイチであれば ゲルやえいどうよりはサンプルに問題があるかもしれません(たしかに マーカーとサンプルでは環境が可也違いますので微妙なところは 見逃される可能せいがありますが)。 もしかしたらサンプルの濃度が濃いのではと思ったりします。 サンプルバッファー加えた状態で0.5-1mg/ml位になるように するのがいいかと思いますが、実際のところどの程度の 濃度になっていますか?

(無題) 削除/引用 No.397-8 - 2009/04/27 (月) 22:44:26 - 小児科医師（ゆとり教育） ところで、βMEの作用ってどのようなものなのですか？

(無題) 削除/引用 No.397-7 - 2009/04/27 (月) 21:35:36 - ノンスペ まだまだ勉強不足で知らないことばかりなので、本当に助かりました。みなさまありがとうございました。 名無しさん とてもよく分かりました。教えていただいた方法でチャレンジしてみます。ありがとうございました！ APさん ありがとうございます。注射針は21Gで大丈夫でしょうか？また、注射針を通したあと、再度遠心は必要でしょうか？アドバイスいただけると幸いです。 おおさん 泳動バッファーの組成は大丈夫だと書きましたが、泳動バッファーに使ったSDSも古いものでした。時々サンプルが途中から二股みたいに割れることがあります。新しいSDSを泳動バッファーに用いて再度トライしてみようと思います。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.397-6 - 2009/04/27 (月) 00:58:32 - 名無し 作り置きは問題ないです。そうやってる人多いとおもいます。室温保存で構いません。冷蔵、冷凍だとSDSが析出するので、それを毎回いちいち溶かすのが面倒ですし、完全にに溶けてないとトラブルの原因になるので。 電気泳動後にLC-MS/MSとかにもっていく時だけは、コンタミを減らすために面倒でも手袋して粉から用事調製したほうがいいです。こんな小さい事でも結構違います。 作り置きbufferにはβMEは入れないようにして下さい。低濃度で長期間置いておくとだんだん酸化されて働かなくなってきますから。bMEは電気泳動前のサンプル調製の時にサンプルに必要量加えるというほうがいいです。

(無題) 削除/引用 No.397-5 - 2009/04/27 (月) 00:57:58 - AP 高分子に縦線がどべーという状況は、サンプル中のDNAによるアグリゲーション、ゲルマトリックスの詰まりを疑わせます。抽出方法をモディファイしてDNAが除去できるようにするか、DNAが十分にせん断され粘性がなくなるまで注射針を通すなどしてみては。

(無題) 削除/引用 No.397-4 - 2009/04/26 (日) 23:33:01 - ノンスペ Re:おおさん アドバイスありがとうございます。 使った抗体はAMPKとGRで、違う抗原に対する抗体です。マーカーはきれいに流れています。泳動バッファーの組成も大丈夫だと思います。タンパク定量はBCA法にてスタンダードをとって行いました。1次抗体、2次抗体濃度をさらに薄くして検討してみます。 Re:名無しさん ありがとうございます。試薬棚を確認したところ、SDSは５年前、bMEは４年前に購入、開封したものでした・・・。新しい試薬でサンプルバッファーを作り直してみます。サンプルバッファーは作り置きして冷凍保存などすることはできますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.397-3 - 2009/04/26 (日) 22:33:03 - おお 使われたそれらの抗体は違う抗原にたいする抗体でしょうか? 電気えいどうが原因かもしれませんね。 もしそうなら、SDSPAGE後CBBでそめるか、トランスファー後に 総タンパクをそめてきれいに流れているか確認してください。 マーカーはきれいに流れているでしょうか? たまにえいどうそうのバッファーの組成や濃度を間違って えいどうが乱れるといったトラブルを起こす方がいます。 0.1%SDSは必須です。入ってなくても、多くてもトラブルになります。 タンパク量に間違えはないですか?どのようにはかりましたか? スタンダードはとってますか? もう一つはその抗原がそういう性質ということはないでしょうか? ユビキチンとか、、、、 もし電気えいどうに問題がなく、ノンすべなら抗体の濃度を下げるのも てかと思います。1次抗体、2次抗体とも1/3ぐらい薄くしてみては どうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.397-2 - 2009/04/26 (日) 22:13:31 - 名無し westernの問題でなくてサンプルの問題と思います。手袋して、できれば新しい試薬でサンプルバッファーを作り直してみたらどうでしょうか。特にSDS（グレード高いやつがいい）とbMEは特に新しいやつ買って試してみることを勧めます。あとレーンあたりの添加量はもっと減らせるとおもいます。蛋白質量に対してSDSが不足しないようにSDSサンプルの蛋白質濃度は1mg/ml以下くらいにしてみたらどうでしょうか。サンプルは電気泳動前には遠心しましょう。不溶物があると縦に縞模様がでたりして良くないです。 アーティファクトでなくて、もともと何か修飾受けてる可能性ももちろんあり得ますが、そんなに激しいシグナルがでることはあまり無いような気がします。

ウェスタンのノンスペについて 削除/引用 No.397-1 - 2009/04/26 (日) 21:52:14 - ノンスペ ウェスタンブロッティング初心者です。よろしくお願いします。 現在、ノンスペに困っています。目的のタンパクよりも高分子のところにノンスペがドバーっとでてしまいます。発光させた際、分子量が高い側ほどグラデーション状に黒くなってしまいます。目的タンパクは一応バンドとして確認できますが、高分子側に縦にラインができてしまっているので見にくくなってしまいます。 タンパク濃度(20-40ug)や抗体濃度を変えてみたり、ブロッキング溶液をスキムミルクからBSAに変えてみたり、ECLをミリポア社からGE社に変えてみたり、いろいろ試してみましたが、効果はありませんでした。どの段階でのミスなのかわからず困っています。抗体の種類を変えても同じようにノンスペがでてくるので、サンプル調整の段階で問題があるのでしょうか？組織はマウスの脳ですが、プロテアーゼ阻害剤MixとともにLysisに溶かしてホモジネートしたものを遠心し、上清をとり、凍結保存しています。これを溶解してSDSサンプルバッファー(2-ME込み)と等量混ぜて、95℃で２分加熱し、ウェルにアプライしています。

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