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(無題) 削除/引用 No.3967-13 - 2011/02/16 (水) 01:04:22 - 製品名がねえ http://www.bio.toyobo.co.jp/bio01/file/FSQ-101.pdf 東洋紡の製品は最初の方が仰るとおりRT、すなわちreverse transcriptionするだけのものなんですね。　自分は製品名からPCRも行えるのかと思ってしまいました。　　だから、このキットで合成されるのは質問者さんの理解どおり一本鎖cDNAですね。 あと、最初の2分は一本鎖cDNAをピンとさせたり、RNA-DNA二本鎖を離れさせたりするのにあったほうがいいでしょうね。なくてもサイクルの初めの熱変性で同じようなことが期待できるでしょうけども。ただ、無いと発現量の低いものなんかは増えにくい、検出できないってことになるかもね。 あんまり難しく考えないで頑張ってくださいね。

もちろん 削除/引用 No.3967-12 - 2011/02/13 (日) 02:05:19 - お Polymerase Chain Reactionです。連投失礼しました。

RT-qPCR 削除/引用 No.3967-11 - 2011/02/13 (日) 02:04:13 - お 私は RT-qPCR (Reverse Transcription - quantitative Plymerase Chain Reaction)と表記しています。 以前同じラボのスタッフで、プレゼンの際にRT-PCRと記載してある所をいつもReal Time PCRと読み上げているものがいて、知ってる人には恥ずかしいし、知らない人には間違った知識を与えるからやめた方がいい、と何度か忠告したのですがなかなか直りませんでした。

(無題) 削除/引用 No.3967-10 - 2011/02/11 (金) 10:46:20 - え？ >RT (Reverse Transcription) : mRNA を鋳型にして一本鎖 DNA (cDNA) を合成すること >RT-PCR (RealTime-PCR) : 経時的に DNA の量を測定することで定量を行う PCR 念のため。昔から、 RT-PCRは、Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction でしょう。 リアルタイムPCRが普及してきて、 RTが、Reverse TranscriptionとReal Timeで間違いやすいため、 Real Timeは、quantitative real time polymerase chain reactionから qPCRとかQ-PCRとか言われたり表記したりします。 qRT-PCRと表記する人もいますが、混乱しやすいので私は使いません。

(無題) 削除/引用 No.3967-9 - 2011/02/10 (木) 20:10:46 - a RT (Reverse Transcription) : mRNA を鋳型にして一本鎖 DNA (cDNA) を合成すること RT-PCR (RealTime-PCR) : 経時的に DNA の量を測定することで定量を行う PCR

(無題) 削除/引用 No.3967-8 - 2011/02/10 (木) 18:24:26 - よっしー 修飾されたDNA polymeraseを活性化するためのサイクル(ホットスタート法)ではないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3967-7 - 2011/02/10 (木) 18:04:37 - 長崎の田舎者 RTの鋳型であるRNAと合成されたcDNAを離すためでしょ。

(無題) 削除/引用 No.3967-6 - 2011/02/10 (木) 18:01:30 - ＊＊＊ 1. RT反応で合成されるcDNAは1st strandのみですが、鋳型RNAと対合している可能性があります（ReverTra AceはRNase H-なので、鋳型に用いたRNAはそのままPCR反応溶液に持ち越されます）。ですから、PCRの最初に変性ステップがなければ増幅は悪くなる可能性があります。それから、たとえPCRの前にRNAを分解してcDNA 1st strandのみにしていても、1本鎖の核酸も多かれ少なかれ分子内で二次構造を形成しているでしょうから、最低限の変性ステップは必要です。 2. 東洋紡が推奨している「最初の94℃, 2 min」が必要か不要かというのは、別の問題かもしれません。その後の温度サイクルに94℃, 30 secがありますから、一般的な鋳型は（dsDNAにしろRNA-cDNAハイブリッドにしろ）それで十分変性できると思います。特に長距離を増やすとかGC-richとかでなければ、最初の+2 minは増幅そのものにはあまり影響しないでしょう。ただし、目的がqPCRである場合には+2 minのあり/なしが定量結果に影響するかもしれませんから、変更しない方がよいと思います。 ＊マーさんの文章中では「RT」と「RT-PCR」という言葉が混同されているようですので、気をつけてください。ReverTraAce qPCR RT Kitで行えるのはcDNAを合成する「RT」の反応のみです。DNAを増幅する「PCR」の部分は、その後に別の試薬/キットを用いて行います。これら2つの操作を合わせて初めて「RT-PCR」と呼びます。

RT-PCR 削除/引用 No.3967-1 - 2011/02/10 (木) 16:43:21 - マー RT-PCRの初心者です。 教えて頂きたいのですが、RT-PCRによって、cDNAを合成した後PCR反応を行なう2stepの方法で実験しているのですが、厳密にいうと、RT-PCRで行なわれるのは、一本鎖cDNAの合成まででしょうか。 PCRの条件を、94℃2分の後に、94℃(30s)→55℃(30s)→72℃(1min)を30サイクル行なっているのですが、最初の94℃2minは、2本鎖を1本鎖にするためのものだと理解しており、もしRT-PCRで合成されているものが1本鎖なら、最初の2分は必要なのでしょうか？ もしかすると、私の理解が間違っていますか？ どなたかご教授頂ければと思います。 ちなみに、RT-PCRで使用しているkitは、TOYOBOのReverTraAce qPCR RT KItというものです。

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