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ありがとうございます 削除/引用 No.3943-3 - 2011/02/10 (木) 01:05:18 - SP6 とおりすがり様、ご回答ありがとうございます。 なるほど、GGGが良いのですね、クラスIIIのT7プロモーター配列を調べたり 試行錯誤していましたが、大変希望がでてきました。是非、ご指摘の点から実験してみたいと思います。また、試薬についての情報も大変参考になります。購入を検討させて頂きます。 ありがとうございました。

in vitro transcription 削除/引用 No.3943-2 - 2011/02/08 (火) 20:15:56 - とおりすがり 遠い昔、修論のテーマでちょっとだけやったことがあります。 あまり参考にならない気もしますが…。 T7プロモーター直後の配列は何ですか？ GGGからスタートじゃないとものすごく転写効率が落ちます。 あと、Rocheとは間逆ですが 37℃でO/Nでやるとよかったときもありました。 PCR産物は電気泳動でラダーでないことを確認しましたか？ あとは思い切って酵素を変えるとか。 http://www.epibio.com/cellscript.asp のT7キットは高価ですが効率がとてもよかったです。 あまりお役に立てずすみません。

in vitro 転写反応 削除/引用 No.3943-1 - 2011/02/05 (土) 14:21:01 - SP6 現在、以下のような材料でin vitro転写実験を行っています。 ・invitrogen T7 polymerase ・0.5 mM〜2.5 mMまでのNTP ・RNase inhibitor ・5'端にT7 promoter（pETベクターを参考にプライマーを設計）を もつPCR断片。PCR産物は精製せず、反応液全量の10分の1にあたる 2 uLを使用しています。また、3'側にはORFの後、約1000 bpのベクター配列を もたせています。 ・37度で6時間反応 本条件で、効率よく転写される遺伝子もあるのですが、 極めて薄くしか転写物が得られないケースが多々あります。 Rocheのキットには反応時間が長すぎると収量がおちるとある、との コメントを過去ログに見つけましたが、その原因がわかりません。 どのようなことでも教えていただければ助かります。

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