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(無題) 削除/引用 No.394-17 - 2009/04/25 (土) 12:57:12 - あべちゃん みなさん、 色々本当にありがとうございます。大変勉強になります。 Pumpkinさん、激安王さん、 シーケンスサービスについて、どこに依頼するか検討しようと思います。ありがとうございました。 最終的にはケースバイケースだと思いますが、安全を買うという事に納得しました。 切り貼りをしたときも、最低でも片側はシーケンスを読もうと思います。

(無題) 削除/引用 No.394-16 - 2009/04/25 (土) 09:09:41 - ~ >Tbさん たまたま拾ったクローンのインサートのC末側が100bp位無くなっていて、 入れた薬剤耐性遺伝子が耐性を示さなくなったことがありました。 100bpも削れたので本来は電気泳動でも見れる条件はあったはずですが、 結構長いインサートを入れていて、 適当に電気泳動してインサートが入っているのを確認していたために気づきませんでした。 気づいたのは細胞に入れて薬剤耐性の濃度を検討した時で、 その頃には既に調べたい遺伝子も入れ終わっていたので、 結構な時間のロスをしました。 そのときは結果として削れたのが100bp位で薬剤耐性遺伝子であったために、 電気泳動で見ることができる条件で、 細胞に入れることで表現型を確認できる状況だったので、 ちゃんと電気泳動するか、複数クローンを細胞に入れてみて確認することが出来る状況でした。 そのため薬剤耐性遺伝子を入れた時点で複数クローンを細胞に入れていれば、 薬剤耐性が出ないクローンとしてはねられたはずですが、 　サブクローニングで期待されるサイズくらいのインサートが入っていた 　それに目的の遺伝子を入れるために1クローンを選ぶ必要があった の2点のために手抜きをしたのが失敗の原因だと思います。 ただ、 １．制限酵素地図を作って判別できる変異であるかは配列を読んで初めて分かる。 ２．複数クローンをトランスフェクションして異なる結果になったときに、結局は配列があっているかで判別することになる (3クローンをトランスフェクションして、2クローンで出た方の表現型が正しいといえる根拠が無い) の理由から、配列を読んだ方が効率がいいと考えています。 それをやったときに、16連キャピラリーのシークエンサーがある研究室にいて、シークエンスを読み放題だったからというのもあります。

すいません、勘違いでした 削除/引用 No.394-15 - 2009/04/25 (土) 05:49:19 - Tb ~さんの削られたというのは、別ベクターにligationした時の話ですね。勝手に、単に増幅し直したときに飛んだのかと思って変な質問してしまいました。すいません。

(無題) 削除/引用 No.394-13 - 2009/04/25 (土) 05:30:26 - おお わたしは場合によりますがしないほうがたいていです。 ぶらんとエンドを作った時けずりこみなどたまに経験します。 しかしそのジャンクションが制限酵素の認識部位が保存されているか いないかで判断できる時は必要なしとおもっています。 またプラントで上記のほうほうで確認できない時、 フレームがずれる可能性があるときは、大腸菌りこんビナンと やマンマル過剰発現でサイズで判断できる時は 複数クローンためして変なクローンを拾ってないか 確認できます。 そのほかのばあいは配列を確認するかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.394-12 - 2009/04/25 (土) 04:57:31 - 激安王 850円/1run がありますよ。 http://www.macrogen-japan.co.jp/www/main.jsp

~さんのケースを教えてください 削除/引用 No.394-11 - 2009/04/25 (土) 02:33:08 - Tb まったくの興味本位なのですが、~さんの > 以前、ウイルスベクターで削れてえらい目にあったことがあるので、 とは、発現したい遺伝子部位が削れたのでしょうか？それは制限酵素で接続した端でしょうか？それとも真ん中ですか？ ウイルスベクターは5'LTRと3'LTRで相同配列を持っているので、リコンビネーションがまま起こりますが、これとは別の現象ですか？ 私も最近気付いたこととして、持っているレトロウイルスベクターのIRES配列に、リファレンス配列にないCCCCCCCCという変な配列が挿入されているのに気付きました。そのあとに作ったものではこのCが一個減っていて、さらにそのあとのものはCがもっと減っていた、となんか動いているようです。昔のシークエンスデータをさかのぼっていつから、どのような傾向で変わってきているのか調べようと思いつつ、機能にはあんまり影響ないようなのでほったらかしにしていました。ちなみに使っている大腸菌はJM109です。なんでこんなことが起きるのか知りたいです。

(無題) 削除/引用 No.394-10 - 2009/04/25 (土) 01:12:17 - ~ 以前、ウイルスベクターで削れてえらい目にあったことがあるので、 インサートは読むようにしています。 両側から読んでも全長が読めない場合に、 結合部分が削れていないかを確認して終わりにするときはありますが。 >大腸菌ホストで失敗した ウイルスベクターで、DH10Bに入れたら削れて使い物にならなくなったことがあります。 Stbl2などに入れて解決しました。

(無題) 削除/引用 No.394-9 - 2009/04/24 (金) 22:56:12 - 基本的にシークエンスしません 私も、（誰も聞いてませんけど）、プラスミド由来の遺伝子のサブクローンは基本的にシークエンスしません。ただし、これも指摘にあるように、蛋白質のフュージョンになる部分があるときは必ずやるようにしています。 １）これも、ライゲーションしてサイトがつぶれる（SmaI とEcoRVとか)　場合以外は必要ないような気がしますが、実際にBamHIが再生する場合などでフレームがずれたとかの経験のある方いますか？　（私の場合は勘違いの単純ミスがたまにあります） ２）巨大な遺伝子の場合、プラスミド由来の遺伝子のサブクローンで配列が明らかに変わっていたということの経験がある方いますか？？　私はまずないと思っているのですが、、、 ３）大腸菌ホストで失敗した経験のあるかたいますか？

(無題) 削除/引用 No.394-8 - 2009/04/24 (金) 21:49:35 - Pumpkin あべちゃん様 1 runは電気泳動のみですよね？であれば、もうちょっと安いところがあると思います。 www.ghbrm.com/expo/dna/sequence1.php TaKaRaも8連でいければほんの少し安いと思います。

(無題) 削除/引用 No.394-7 - 2009/04/24 (金) 21:25:06 - あべちゃん >[Re:6] Pumpkinさんは書きました : > でも、\1600/runはちょっと高いですね。1 run=1 シーケンスってことですよね？1 run 12シーケンスとかだったら安いですけど、次世代シーケンスは1 run でGbデータとかいってますから、恐ろしい時代になりましたね。 1 run \1,600です。invitrogenさんの所です。 おそらく、一度にたくさんのサンプルを依頼するのであれば、もう少し安いのですが、多くて20 runとかですから。 それとも、もっと安いところがあるのでしょうか？ 話が逸れてしまいました

(無題) 削除/引用 No.394-6 - 2009/04/24 (金) 21:03:44 - Pumpkin いまや、次世代型シークエンサーでちょちょいというところまで来ていますが、ショットガンでキャピラリーは確かにアレルギーになってもしかたないかもですね。 私も外注（正式にはちょっと違いますが）ですよ。ラボというか大学にシークエンサーがありません。逆にそういう時代なのかもしれないと思い始めました。ランニングコストというか、メンテナンスを考えたら頻用しなければ外注のほうが安いと思います。 でも、\1600/runはちょっと高いですね。1 run=1 シーケンスってことですよね？1 run 12シーケンスとかだったら安いですけど、次世代シーケンスは1 run でGbデータとかいってますから、恐ろしい時代になりましたね。

(無題) 削除/引用 No.394-5 - 2009/04/24 (金) 19:15:41 - あべちゃん 皆さんありがとうございます。 卒研テーマでバクテリアゲノムをひたすらショットガンで解読するというのを丸1年やっていたためか、どうも私はシーケンスアレルギーがあるようです。 当時、1本キャピラリーが出回り始めた頃でした。ザンギさんのおっしゃるように、昔の感覚を引きずっているようです。 少し前のトピックでレポーターベクターのシーケンスを読むべきかという話題でも、皆さんの意見と少し自分が乖離しているなぁと思っていました。 ばいやさんやPumpkinさんがおっしゃるように、安全を買うという意味でもシーケンスチェックは必要ですね。 ・・・ ただ、恐ろしいことに我が研究室（＆施設全体）にシーケンサーが無く、いつも外注しているんですよね。1Run, ￥1600なり

(無題) 削除/引用 No.394-4 - 2009/04/24 (金) 18:43:06 - ザンギ そのコンストラクトを使う実験によるんじゃないですか？ シーケンスの確認するのとその後の実験をやるのと、どちらが手間と費用が かかるかってことで決めればいいと思います。 シーケンス確認の手間とコストは、今の教官が自分で手を動かしていた時代と 比べると一桁以上下がってるかもしれないので、違う判断をしてもいいのでは？

(無題) 削除/引用 No.394-3 - 2009/04/24 (金) 18:36:18 - Pumpkin あべちゃん様、別トピで立ち上げて頂き恐縮です。 私は、ばいやさんとほぼ同意見です。発現ベクターへ乗せ換えた時には、変異が入ることはないでしょうが、安心をかってやってしまうのです。 >プラスミドを精製するたびにもシーケンスチェックはしません。 というのは、たとえばクローニングされて一度はシークエンスされているプラスミドのことですよね？であれば、私もしません。 >作業を独立して何回か行い、統計的に優位性が示されれば良い サブクローニングしたプラスミドも一度は読んでおけば、プラスミド取りから有意性を見る必要はないのではないですか？確実な目的断片を持つプラスミドをアッセイに用いて、トランスフェクションからで統計をとればよい気がしますが、どこかくみ取りまちがえているでしょうか。 ばいやさんがおっしゃるとおり、今では気軽にシークエンスできるので、やっておくと安心という観点でやっています。常にシークエンサーが回っている状態にちょっこと乗せてもらうだけなので、これをやることによる弊害は今のところ無いと思っています。

(無題) 削除/引用 No.394-2 - 2009/04/24 (金) 18:16:01 - ばいや PCR増幅したときは全長必ずします。 融合発現する目的でフレームを合わせるときも必ずします。 これは時々自分の勘違いなどでフレームがずれているときがあるからです。 サブクローニングは発現ベクターの場合、最終段階で片側だけでもシークエンスします。それ以外はしません。 昔はシークエンスが大変だったから全くしませんでしたが、今は楽なのですることも多いです。安心材料としても。

サブクローニングでシーケンスするか 削除/引用 No.394-1 - 2009/04/24 (金) 17:59:15 - あべちゃん 苦労人さんのトピのなかのPumpkinさんのレスで、気になったので（でも本題と逸れるので）、別トピで皆さんのご意見を聞かせて下さい。 私はサブクローニングでシーケンスはしません。（もちろん、プラスミドを精製するたびにもシーケンスチェックはしません。制限酵素による簡単なカットパターンのチェックのみです） 特にサブクローニングにおいてシーケンスチェックが必要かどうか、 昔、同じ点で気になったので、当時の指導教官だった先生に意見を伺い、 グリストからプレートに線画培養し、シングルコロニーからプラスミドを取る。 培養細胞などへトランスフェクションし、アッセイなどへ持って行く。 この作業を独立して何回か行い、統計的に優位性が示されれば良いので、シーケンスをする必要はないと説明を受け、私も納得し今に至ります。 でも、すこしひっかかっています。 重複しますが、皆さんはどうお考えでしょうか？ よろしくお願いします。

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