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(無題) 削除/引用 No.3923-9 - 2011/02/03 (木) 08:32:38 - Actias nanaさん うちでもuncutのプラスミドの泳動をしています。 1. Uncutでも、概ねそのプラスミド特有の泳動パターン（サイズや本数）が得られます。 2. Cut「切れなかったとき」の対照です。「酵素消化が不十分なときの余計なバンドの位置」の指標になりますし、「酵素反応をしたサンプルのDNAが消えた（薄まった）」ときの初期量の目安にもなります。 トピ主さんの話が分からないので、可能性を列挙すると、 余計なバンドは、 1. 別クローンのコンタミ 2. 大腸菌ゲノムも見ている(uncut時） 3. 培養中のdeletion（気難しいクローンで起こることがある) 4. 酵素反応の不十分 それぞれの対処法はすでに他の方が書かれていると思うので、省きます。

(無題) 削除/引用 No.3923-8 - 2011/02/02 (水) 14:45:33 - ~ もしかしたらトラブルが起きているのかもしれませんが、読んでもトラブルなのか、見間違えているのかが分かりません。 まず、環状DNAと線状DNAでは、同じ移動度であっても同じサイズとは限りません。それは分かっていますでしょうか？ 同じ位置、異なる位置などと表現するから相手に伝わりにくいのだと思います。 想定されるバンドは約何kb、何kbで、検出されたバンドは何kbと何kbと何kbと言えば、本数や計何kbなのかなどが伝わりやすくなります。 （バンドが2本重なっている可能性の前に、今見えているバンドで妥当かどうかすら伝わっていないと思います） とりあえず、1 cutの酵素で切断するのが理解する近道かと思います。 （ベクターとインサートをが繋がった状態で1 cutでしか切れない酵素です） それで1本のバンドになれば、no cutで複数見れていたバンドが高次構造の違いであることが理解できるでしょう。 もしかしたら、 >使用した元のベクターにおいて、2箇所切断される酵素を使用した場合。異常なサンプルでも２本のバンドを確認することができるのですが、想定している長さとは全く異なる長さのバンドが確認できています。 についてはトラブルが起きているのかもしれません。 ただ、情報が足りず、考え方を間違えているか、デリーションなどのトラブルが起きているかすら分かりません。 分からないのは、 �@全く異なる長さのバンドは2本のバンド数に含まれている？それとも3本目以降のバンド？ �A元のベクターで2箇所切れるとして、インサートを入れた場合には何箇所となり、インサートの向きが異なる場合にそれぞれどういう制限酵素パターンが想定される？ の情報です。 no cutでの泳動の話が混ざっているので何を言っているのかよく分かりませんが、もしかしたらデリーションが起きているのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3923-7 - 2011/02/02 (水) 13:30:36 - AP 説明がお上手ではないようで、読めば読むほど状況がよくわからなくなってきたのですが、 消化していないプラスミドなら、無傷でスーパーコイルしているcccと、ニックが入って開環状になったopen circular (oc)の二本のバンドが出るのはあたりまえですが、それのこと？ 最近になってニックが入りやすくなってocが目立ってきたということではないですか？ 異常な長さのバンドというのは、もちろんなにか間違ったインサートの可能性が入った可能性もありますが、私は不完全硝化を疑います。未消化のサンプルと、消化したサンプルをside-by-sideで泳動したとき、異常なバンドというのが、両者で一致しているバンドだったりしませんか。 不完全消化はよくあることです。制限酵素の効き具合は、DNAの精製度や投入量のぶれで変わります。また、アルカリSDS法の場合、アルカリ処理のちょっとしたぶれで処理が過剰になり、ccccが部分変性します。移動度は未変性のcccとほとんど同じかやや早い程度です。この部分変性したcccは制限酵素が全く効きません。一部のcccがそうなっていると、切れたリニアのバンドと、変性cccのバンドがでますし、全部が変性していると切れたバンドと思ったのものが実は変性cccだということもあり得ます。

(無題) 削除/引用 No.3923-6 - 2011/02/02 (水) 11:48:14 - ami > 高次構造も考えたのですが、数回電気泳動を行った結果、違うと考えています。 > 使用した元のベクターにおいて、２箇所切断される酵素を使用した場合。異常なサンプルでも２本のバンドを確認することができるのですが、想定している長さとは全く異なる長さのバンドが確認できています。また、この場合でも、ノンカットのサンプルとカットしたサンプルには、同じ長さのバンドを確認できています。 > 短くなった場合では、全長が元のベクターより半分以下になっていました。 ここからは全然、高次構造の可能性が否定されてないと思いますけど･･･。 12KBのベクターでも、切らないと3KBくらいに見えたりしますし･･･。

(無題) 削除/引用 No.3923-5 - 2011/02/02 (水) 11:13:14 - nana 制限酵素処理を行なわずにプラスミドDNAを電気泳動する目的がよくわからないのですが．．．もしよろしければ教えていただけますか？ 制限酵素処理を行なわずにプラスミドDNAを電気泳動した場合、次の3種類の分子が存在し、それぞれ異なるバンドとして見ることができるのではないでしょうか。 ・切れ目のない環状DNA ・二重鎖の片方だけが切れた（ニックが入った）環状DNA ・二重鎖が切れた直鎖状DNA 電気泳動ゲル状でどの分子がどの位置にくるかを予見できるのか、ちょっとわからないのですが（あまり意味があるとも思えませんし）。 もしかして、上記の3種類の比率をみるために未処理のDNAを流しているのでしょうか。その場合、染色試薬による染色効率が互いに異なると考えられますので、これまたあまり意味がないとは思いますが．．． 勝手な想像で申し上げました。

(無題) 削除/引用 No.3923-4 - 2011/02/02 (水) 10:22:14 - 774 異常なサンプルは制限酵素の認識サイトがなくなってるのでは？ 目的の半分くらいの長さになるときは断片が同じ大きさで偶然重なって見える可能性もあります。 何が起こったのかを知りたかったら、制限酵素の種類を変えて正確な長さを見積もるのがいいかもしれません。 さらにシークエンスでもしてみるとか。

(無題) 削除/引用 No.3923-3 - 2011/02/02 (水) 10:03:36 - 素人学生 高次構造も考えたのですが、数回電気泳動を行った結果、違うと考えています。 使用した元のベクターにおいて、２箇所切断される酵素を使用した場合。異常なサンプルでも２本のバンドを確認することができるのですが、想定している長さとは全く異なる長さのバンドが確認できています。また、この場合でも、ノンカットのサンプルとカットしたサンプルには、同じ長さのバンドを確認できています。 短くなった場合では、全長が元のベクターより半分以下になっていました。

(無題) 削除/引用 No.3923-2 - 2011/02/02 (水) 09:40:54 - ぺにー えっとよく読んでないけどplasmidのとる高次構造をみてるんじゃないの？

ノンカットのサンプルで複数のバンドが出る理由 削除/引用 No.3923-1 - 2011/02/02 (水) 09:38:54 - 素人学生 10000 bpのベクターに、突出末端を酵素処理により平滑末端にした2000 bpのインサートを挿入する実験を行っています。 ベクター側は、CIP処理により脱リン酸化処理を行ってあります。 プロトコールに従ってライゲーションを行い、ミニプレップでサンプルを得ています。そして、作製されたサンプルは、酵素処理を行った場合と行わない場合の二種類用意し、アガロースゲル電気泳動をしています。 最近、酵素処理を行っていないサンプルにも2本のバンドがはっきりと確認できるサンプルや、元のベクターよりも極端に長さの異なるサンプルがよく出るようになりました。 どなたか、この現象についてご存知の方はいらっしゃいませんか？ ご教授よろしくお願い致します。

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