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(無題) 削除/引用 No.3913-27 - 2011/02/03 (木) 08:57:04 - 新参者 TK-1様 　 　確かに培養された液には分泌されたβラクタマーゼがありそこに反応基質のAMPをわざわざ添加している感じになってしまいますよね。ミニプレップなどの培養には2日前に再形質転換を行ったプレートからシングルコロニーをピックアップし、培養することで解決しようと思います。 310様 　 　ODから増殖曲線を引くわけですね。毒性タンパクが死滅期で効いてくるの場合は310様のように対数曲線内での増殖にとどめることは有効ということでしょうか。やってみようと思います。また、やはり、皆様のご指摘のようにAMPの失活も考慮に入れた方がよいように思えたので、新しいもので、一度行ってみようかと思います。 AP様 　colE1 replicon1にも種類があるのですか。ベクターの情報を再度確認したのですがcolE1 repliconとしか記載されていなく、このような場合は、シークエンスから由来がわかるのでしょうか。ベクターの骨格についても、記載されていないのか、身落とししているのかわからないので説明書のどの部分を確認すればよいのでしょうか。 　カナマイシンについては安易に考えすぎました。 　pLysS株についてベクターにも、大腸菌genotypeにもT7 RNA polと記載されていないので今回は用いることができないように思います。 　ただ、ベクターのPropagation in E.coliという部位にcopy number highと記載されていて、これはベクターの機能か、形質転換に求められるコンピテントセルに求められる性質かわかりませんが、後者であるならコピー数の高くなる大腸菌に再形質転換を行いたいと思います。 　teriffic brothはラボにあるのでやってみようと思います。 ンンノ様 　 　ミニプレップの全培養にて低温培養を検討してみます。 中年様 　ベクター説明書にはcolE1 oriとしか記載されていなかったのでどちら由来かは申し訳ないのですがわからなかったです。

(無題) 削除/引用 No.3913-26 - 2011/02/02 (水) 20:14:17 - AP >市販のプラスミドだと本来のpMB1 oriとpUC型のoriとを区別せずcolE1 oriと表記している場合が多いので なるほど、そういう解釈もありますね。 とにかく、これまでの論議で質問者さんは、はじめに言った、特定のベクター名を明らかにできなくても、ベクターの骨格（たとえばpUCベースだとかpBRベースだとか）を明かす必要がある、という点は理解されたんじゃないでしょうか。それによって、有効な手段、有効ではない手段が決まってきますので。 とりうる対処法としてひとつ付け加えると、培地をリッチなもの、2xYTとかTerrific brothなどに変えてみるというのもあります。たとえばTerrific brothだと同じ培養スケールでもLBの5倍くらいの菌数が得られますので、スケールアップと同等の結果が得られます。

(無題) 削除/引用 No.3913-24 - 2011/02/02 (水) 14:52:25 - 中年 コピー数制御の温度感受性に関してはAPさんの仰るとおりです。ただ、トピ主さんはcolE1 oriとお書きになっていますが、市販のプラスミドだと本来のpMB1 oriとpUC型のoriとを区別せずcolE1 oriと表記している場合が多いので、この場合もそうだと独り合点しておりました。 で、実際にはどうなんでしょう？良く取れるクローンの収量からするとpUC型のように思いますが。

低温培養 削除/引用 No.3913-23 - 2011/02/02 (水) 13:59:10 - ンンノ プラスミドの複製機構ということに関してはAPさんのご説明のとおりですが、 経験的には中年さんのおっしゃるように収量は落ちるけども失敗することが 少ないように感じています。 系統的あるいは統計的には考察しておりませんので、オカルトかもしれませんが。 多数のプラスミドを同時に使用する必要がある場合などで失敗したくないと きには、形質転換後のプレート培養からすべて３０度で行っています。

(無題) 削除/引用 No.3913-22 - 2011/02/02 (水) 11:30:07 - AP 低温培養でコピー数が減るのはpUCなど、複製開始の正の調節因子であるRNAIIに点突然変異をもつ、変異型のpMB1 repliconだけではなかったですか。原理的に、野生型pMB1や、pBR322などのcolE1 repliconにこの効果をもとめるのは意味がないはず。 作用機序がタンパク質合成阻害だからといって、クロラムフェニコールをカナマイシンに置き換えることはできません。濃度にもよると思いますが、カナマイシンは静菌的作用より殺菌的作用が強いので、コピー数をふやすより先に死んでしまうでしょう。 pLysSはコードされるT7 lysozymeがT7 RNA polに結合して転写を阻害することで発現を抑えます。ベクターにT7プロモータがあっても、宿主ーベクター系にT7 RNA polの遺伝子がなければ意味ないでしょう。

OD600 削除/引用 No.3913-21 - 2011/02/02 (水) 09:10:56 - 310 私が似たような目に会ったときやったのは 最初だけでもOD600で1時間ー数時間、大腸菌の濃度を測定し増殖曲線を描き、次回からはそれを参考に対数増殖期が終わるまでに培養を終えるように吸光度測定することです。これだと収量はやや少なめになるので、できる限り培養本数をふやすと良いでしょう。 最近使っているのはSmart Ampicillinです。日本ではコスモバイオ http://www.cosmobio.co.jp/product/bunshiseibutsu/cat355/cat375/00870005.asp?entry_id=2269 及びフナコシで購入できます。 http://www.funakoshi.co.jp/node/14886 寒天培地用に購入したのですが、液体培地でも使ったところ気持ち収率が上がったような気がしました。しかし、メーカーの言うように4℃保存しようと冷蔵庫に入れたら、庫内温度の変動のためかすぐ失活しました.今は小分け＆-20℃で保存しており、問題はありません。 抗生物質の失活は形質転換してない大腸菌を入れて一晩培養すれば分かりますので、ネガコンとして形質転換菌と一緒の培養機で培養しています。 本当にSmart Ampicillinが分解されないアンピシリンなのかは私では分かりません。多分分解しにくい程度ではと思っています。このため夕方から培地数mlで数時間培養し、遠心して8mlの培地に再縣濁して一晩培養した後に遠心チューブに培養液をデカントで移し、チューブにちょっと残った培養液に再度培地を加え、ミニプレップで収量が悪いとき夕方に再度行えるように培養します。私が使う程度のプラスミドはこれで大体まかなえます。

(無題) 削除/引用 No.3913-20 - 2011/02/02 (水) 01:16:37 - TK-1 濁った時点でのAmpの再添加はほとんど意味がない。KANなどでは、抗生物質耐性はbacteria instrinsicなので、耐性の有る無しでクローンの選択が可能。それに対してbeta lactamaseによる耐性は分泌を介するので、プラスミドが落ちていようといまいと培地中にbeta lactamaseが存在すれば短時間で加えたampが分解されてしまうので、個々のbacteriaが耐性を持っていようがいまいがクローンレベルでの選択制はそれほど期待できない。それに、Ampはbactericidalではなくbacteristaticなのでampを加えたからといって非耐性の菌が即座に死にことはない。細胞壁の合成の阻害剤なので、増えなくなるというのが選択の機序。

(無題) 削除/引用 No.3913-19 - 2011/02/02 (水) 00:51:14 - 新参者 中年様 　 　ご助言を頂いたとおりB-ラクタマーゼ分泌による、AMPの選択性が効いていない気がしてきました。早速明日培養したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3913-18 - 2011/02/02 (水) 00:44:30 - 中年 「低温培養について」 プラスミドに毒性があるのに菌体量が同じなのは、Ampが培養早々に枯渇してその後は選択が掛かっていないため、プラスミドを落とした菌が増えてしまっているからである可能性があります。つまり、菌体量は当てにならないということです。低温培養はコピー数は落ちますが、毒性が緩和されれば培養毎に取れたり取れなかったりというトラブルからは開放されます。 「抗生剤の再添加について」 回収する際の大腸菌の状態(濁度もしくは培養時間)：培地がはっきり濁った頃で良いと思います。 再添加する抗生剤の量：いつもと同じ。ここで目指していることは、菌のポピュレーションの内でプラスミドを落としているもののみを殺すことなので。 再添加してからどれくらい培養するのか：再添加というより培養再開ということですが、その時点でプラスミドを持った菌のみが生き残るので、しばらくすると濁度は急に落ちます。この後、どれだけ培養を続けるかは、毒性によりけり。必要ならこの操作を何度か繰り返して、最後はover night culture並の濁度に持ち込んだほうが収量が稼げるでしょう。 また、「ミニプレップ全（前？）培養懸濁液を10μl程度加えた」とありますが、これをやると新しい培地のAmpはたちまち分解されてしまいますので、ここから後は何の選択も掛かっていない、すなわちプラスミドを落とした菌の生育が勝っているなら、そればっかりになるでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.3913-17 - 2011/02/02 (水) 00:31:00 - 新参者 ~様 グルコースの添加について 　Lacオペロンがあるとグルコースでそれ以下の発現が抑制できるのですね。それにより、毒性タンパク質のE.coliに与える影響を軽減できるんですか。培地はLB培地でグルコースは添加していませんが、ベクターにはLacオペロンは入っていないのでこの方法は使えないようです。 pLysSを持つ株の使用について 　この大腸菌由来のT7 Lysozyme はベクター由来のT7 RNA polymerase を阻害するので毒性タンパク質の発現による影響が軽減できるんですね。皆さんから教えていただいたcopy numberが気になりますが、他の研究室から少しだけならコンピテントセルを頂けるかもしれないので、このような株を頂けないかどうか伺ってみようと思います。 10倍培養について 　最終的に他の手がなかったら実行してみようと思います。ある程度の培養まで行いクロラムフェニコールを添加すると、大腸菌は増殖できないが、増殖する準備だけが盛んに起こり、copy数が上がるとどこかに書いてあったので、これと併用したいと思います。アンピシリンとは異なり、クロラムフェニコールのようにタンパク質合成時点で阻害するカナマイシンで代用してみようと思います。 ンンノ様 　 シングルコロニーをリストーク 　シングルコロニーだと思い複数のコロニーをピックアップしてしまった場合に有効ということですね。やってみようと思います。 大腸菌を変える 　~様にもご指摘いただいたようにpLysSを持つ株について検討してみようと思います。 培養温度を下げる 　今までは37℃で16時間だったのですが、ミニプレなどの際の前培養で温度をそのように低下させた場合、温度条件、抗生剤濃度、培養時間は検討したいと思います。参考までに通常はどのような条件で行うのかお教え願えますか。 中年様 毒性とコロニーの形態について 　コロニーのサイズが小さかったり、透明だったり、盛り上がりが薄かったりはしていませんでした。ですが、今思うと、200mlの培養の際に、以前のミニプレップ全培養懸濁液を10μl程度加えたのをチップの先で確認したのにもかかわらず、増えないということが数回あったので毒性はあるのかもしれません。ただ、ポイントミューテーションの位置が違うだけでそのような差が出るというのは驚きでした。 低温培養について 　毒性は少々あるかもしれませんが、懸濁液として回収できるので、コピー数に問題があるのではないかという気がしてきました。今の収量がさらに減ってしまう可能性があるとのことで、他の方法でできなければ行ってみようと思います。 抗生剤の再添加について 　一度遠心して、再懸濁、再添加する必要があるのですね。差し支えなければ、回収する際の大腸菌の状態(濁度もしくは培養時間)、や再添加する抗生剤の量、そして再添加してからどれくらい培養するのか(濁度もしくは培養時間)についてお教え願えますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3913-16 - 2011/02/02 (水) 00:05:58 - 中年 ミニプレップだと取れたのに、培養スケールを上げると収率が落ちるというトピックは、これまでにも何度も出ています。 www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=3256 www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=3802 www.kenkyuu.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=3023 www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;start=2;Code=251

(無題) 削除/引用 No.3913-15 - 2011/02/01 (火) 23:41:46 - 新参者 　皆様ご意見ありがとうございます。正直言ってここまで助言を頂くことができるとは思っていなかったのでうれしい限りです。さてかなり初歩的なことに躓いてしまっていると感じ、当惑しているため適切な情報が記載できていないように思いますので少し補足させてください不要な情報でしたらすみません。 現在はクローニングを行いQuick changeの方法でポイントミューテーションを複数作成し、発現ベクターの作成を試みております。それぞれについてセレクション後、ミニプレップ(以前の100μg/mlはここです)を行い、得られたDNAをシーケンスおよび発現チェックを行い問題のないことを確認しました。DNAは50μLのEB bufferで溶出し濃度は100μg/ml程度なので、以降の免疫染色での再現性を確認している際に途中で切れてしまうためラージスケール200mlでDNA抽出を行いました。この時点で最終1mlのbuffferTEで溶出しペレットがあるにもかかわらず100μg/mlに満たないのでおかしいと感じ、スケールダウンした次第です。キットや手の問題もあるかと思い1本でミニプレップを行った結果、4,5μg/mlであったので、とりあえず3本で培養し、一度に50μLに溶出したらあるものでは1000μg/mlそしてあるものでは、30μg/mlとうまくいっているのかいないのか?と思い当惑していました。大抵は同じ培養時間で170μｇ/ml程得られたので。ちなみにこれらはベクターの骨格が同じでポイントミューテーションの位置がそれぞれ違うだけです。

(無題) 削除/引用 No.3913-14 - 2011/02/01 (火) 19:20:43 - 中年 毒性が問題になっているのであれば、コロニーの段階で既に異常が見えることが多いと思います。良く取れるクローンに比べて、コロニーのサイズが小さかったり、透明だったり、盛り上がりが薄かったりしませんか。 その場合は、皆さんお書きになっているように、低温培養が有効だと思います。ただし、これはコピー数を落として毒性を緩和する方法ですので、クローン毎のバラツキは少なくなりますが収量は落ちますので、培養スケールは５倍程度に増やす必要があります。 また、Ampを2-4倍になるように途中で加えたとありますが、バリバリの菌体外酵素による分解なのでそんなものじゃ全然足りません。遠心して菌体を回収し、一度培地で洗ってから新たにAmp入りの培地に懸濁し直す必要があります。

(無題) 削除/引用 No.3913-12 - 2011/02/01 (火) 14:10:48 - ンンノ 再形質転換したシングルコロニーから、さらに別のプレートにストリークして シングルコロニーを拾ってみてください。 大腸菌の株を変えてみてください。 プレートの培養温度も含めて３０度あるいは２５度に下げてみてください。

(無題) 削除/引用 No.3913-11 - 2011/02/01 (火) 12:37:36 - ~ 比較対象になっている >以前は100μg/ml程の収量でした。 は以前の話であり、条件も何もありませんよね。これがポイントミューテーション無しの話なのですか？ 同じ骨格、インサートでポイントミューテーションの有無で100ug/mLと10ug/mLになっているのであれば、APさんの書かれているように毒性タンパク質のリークを疑うのが正攻法かと思います。 グルコース添加？ Lacオペロンを使っているのであれば、抑制を強めることが出来ます。 pLysSを持つ株の使用？ 毒性タンパク質の分解を促進できます。 10倍培養する？ 何も考える必要がありません。 必要量が今の10倍で、現在の培養が3mLであれば、10本培養することをお勧めします。 他の検討と異なり、一切の条件検討が要りません。 後でカラムに吸着させる段階で1本にまとめるか、エタ沈でまとめればいいでしょう。 質を心配しているようですが、分析ではなくプロセスによって品質を確保したいのであれば、一切のプロセスを変更しないのが近道です。 それで不要物が10倍に増えると考えるのであれば、条件を変更させたときにその不要物が変動しないことを調べる必要があるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3913-10 - 2011/02/01 (火) 12:18:43 - 新参者 AP様 　 　ご意見ありありがとうございます。colE1 repliconはもともとlow-copy数なのですね。クロラムフェニコールの添加について調べてみたいと思います。 　一般的にlowcopyの場合他にどのようなことに注力すれば改善できるのか、お教えいただけますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3913-9 - 2011/02/01 (火) 12:12:31 - AP colE1 repliconはもともとlow-copy数（15-20 copies/cell; pUCなどhigh-copyなら　>500 copies/cell）なので、そのくらいの収量(500 ng/3 mL culture)でもおかしくないです。単純にスケールアップするか、クロラムフェニコールで細胞あたりのコピー数を増やす方法（pBRなどを増やす方法として実験手引き書に出ているはず）を試してください。

(無題) 削除/引用 No.3913-8 - 2011/02/01 (火) 11:56:06 - 新参者 ~様 　高収量と低収量の時の違いというのはこの場合の、ポイントミューテーョンの うまくいったものと低収量のものということでよろしいでしょうか。 　その場合なのですが特に使用した大腸菌を変更したり、試薬を添加したり、培地、培養時間を変えたり、AMPの濃度を変えたりといったような操作は思い出す限り行っていないように思います。ご意見いただけますでしょうか。よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3913-7 - 2011/02/01 (火) 11:45:43 - ~ クロラムフェニコール添加？ グルコース添加？ endA-株の使用？ pLysSを持つ株の使用？ 10倍培養する？ 高収量と低収量の時の違いくらいは情報を出さないと、見当違いのアドバイスも来ると思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.3913-6 - 2011/02/01 (火) 11:44:33 - 新参者 AP様 　情報不足ですみません。溶出はEB buffer50μLで10μg/ml程度です。用途はトランスフェクションで免疫染色に用い、再現性も見たいので、100μg/ml程得られれば理想的です。そうすれば、複数本を一つのカラムで溶出し、実験間のDNAの質を一定にできますので。 　ベクターについてなのですが、プロモーターはT7 RNA Polymerase promotorでcolE1 oriです。骨格からの検討は思いもつかなかったので、ご意見を頂けると幸いです。

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