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(無題) 削除/引用 No.3902-6 - 2011/02/01 (火) 10:12:36 - ポン吉 10 mM MnCl2 0.3% Triton X-100 100 mM MES buffer (pH 6.5) です。 in vitro GalT assayですので、MES bufferを使用しています。 B4galt1もMn要求性なので、必須です。 >膜が結合した状態の酵素を酵素源として使っていたということでしょうか？ 0.3 % Tx100を加えておりますので、可溶化しているものと考えております。 特に膜画分からIPする場合には、やはりdetergentで可溶化する必要があるかと思います。 ちなみに使用したtagはFLAGです。

貴重なご意見ありがとうございます 削除/引用 No.3902-5 - 2011/01/31 (月) 20:40:37 - ae ポン吉様 ＞膜画分からtagに対する抗体でIPして比較的精製したものを酵素源として使用したこともあります。 膜が結合した状態の酵素を酵素源として使っていたということでしょうか？ その場合は、何に溶かしていましたか？ ~ 様 メーカーに酵素が溶けないことと、活性がみられないことを伝えたところ、酵素量を増やして試してほしいと言われました。 試したところ、結局白濁してしまい、活性はみられませんでした。 替えてもらえるよう頼んでみます。 Boston-Pullman様 ＜尿素で変性溶解後、ゆっくり透析してリフォールディング 最後に試してみます！

(無題) 削除/引用 No.3902-4 - 2011/01/31 (月) 10:07:34 - Boston-Pullman もしギブアップして処分するくらいならば、、、 尿素で変性溶解後、ゆっくり透析してリフォールディング。酵素では試したことがありません。失活覚悟の上で。

(無題) 削除/引用 No.3902-3 - 2011/01/31 (月) 09:36:08 - ~ >酵素を溶かす良い方法はありますでしょうか？ メーカーに連絡する。 指定どおりの条件で溶けなかったのであれば、代替品を要求できると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.3902-2 - 2011/01/29 (土) 15:07:16 - ポン吉 糖転移酵素屋です。 お察しします。 detergent等加えても駄目なんですね。 B4galt1だとgolgiでしょうから、pHもそれで問題ないはずですよね。 >糖転移酵素の合成基質に対する転移活性を調べているものです。 私のlabでは、tagged glycosylaseを一過性に細胞に発現させ、その膜画分を回収したものを酵素源として使用しています。 他の不要な膜画分が反応系に入るのが嫌ならば、膜画分からtagに対する抗体でIPして比較的精製したものを酵素源として使用したこともあります。 後者の場合、backgroundが抑えられ、当然、酵素の目的の基質に対する特異性は上がります。 ですが、購入したとあれば、なんとかそれを使用したいものですね。

購入した糖転移酵素が溶けません。。 削除/引用 No.3902-1 - 2011/01/29 (土) 14:24:29 - ae 糖転移酵素の合成基質に対する転移活性を調べているものです。 ヒト由来β1,4-ガラクトース転移酵素�T（組み換え体、from Saccharomyces cerevisiae、性状：powder, slightly yellow）を購入したのですが、メーカーのプロトコールに書いてあるTris-HCl buffer(pH 7.4)に溶かしたところ白濁してしまい溶けません。 その他にも、miliQ、DMSO、Tris-HCl buffer pH7.4 (1％ TritonX-100入り）に溶かしてみましたが、やはり白濁してしまいます。 白濁していても活性はあるかを確認するため、天然基質のN-アセチルグルコサミンを基質として糖転移活性を測定してみたところ、活性もみられませんでした。 酵素を溶かす良い方法はありますでしょうか？ ご意見お願い致します。

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