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(無題) 削除/引用 No.39-4 - 2009/02/17 (火) 09:50:40 - 入り江 ご意見ありがとうございます。 確かに固定はアーティファクトを生じる可能性があるので、リアルタイムイメージングで見ている現象の方が正しいと思えます。 >[Re:3] TSさんは書きました : > 固定のあと、anti-GFPで免疫染色していますか？ > PFA固定は、GFP蛍光を減弱すると思うんですが、そのせいではないのでしょうか？ anti-GFPで染色も行いましがた、それによってドットが増加して見えるようにはみえませんでした。固定がGFPの発色に影響を与えているわけではなさそうでした。

固定後は直接観察？免疫染色？ 削除/引用 No.39-3 - 2009/02/17 (火) 01:22:33 - TS 固定のあと、anti-GFPで免疫染色していますか？ PFA固定は、GFP蛍光を減弱すると思うんですが、そのせいではないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.39-2 - 2009/02/16 (月) 22:08:01 - 建前 たとえば、Nuclear fociといわれるドット状構造は細胞の固定によって違って見えます。よって、なんらかのアーティファクトを考えに入れる必要があると思います。これは個人的には、論文の成否にかかわる大問題をはらんでいると思います。 真に、細胞内で起こっている現象が、一般には問題になるわけですから、非固定での観察情報が最優先されるべきだと思います。

GFP融合タンパク質の局在の消失 削除/引用 No.39-1 - 2009/02/16 (月) 21:37:00 - 入り江 現在ある刺激においてエンドソームに局在するタンパク質の局在をGFP融合タンパク質を用いて観察しております。 そのタンパク質は普段は細胞質にあるのですが、刺激後エンドソームに局在します。（多数のドット状の局在になります）そのタンパク質は特に膜貫通ドメインはなく、おそらく何らかのタンパク結合、もしくは直接膜にくっ付き局在すると考えております。 問題はそのGFP融合タンパク質のエンドソームへの局在は間違いないのですが、４％PFA固定10分であればドットになって見えますが、15分にするとドットになっている細胞がかなり減ります。 リアルタイムイメージで固定せずにガラスボトムディッシュ観察であれば、その刺激依存的にドットが増加する細胞は固定した場合に比べて多数見えます。 これはPFA固定によってタンパク質がエンドソーム膜から剥がれてしまったのではと考えております。 固定によって膜に局在するタンパク質が剥がれてしまうようなことはみなさん経験したことがありますでしょうか？ もちろん同じエンドソームに局在する他のタンパク質は固定後もドット状に見えるので、エンドソームが壊れているわけではありません。 どなたかよろしくお願いします。

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