全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.388-12 - 2009/05/06 (水) 11:06:44 - おお >[Re:11] SYBR_masterさんは書きました : > >[Re:10] おおさんは書きました : > > うーんやはりこの辺一般的にいわれているのとかわりがないのかなぁ。 > > 書き方悪かったですね。pelletの量に目がいってしまし、supernatantには少ない=上手くいっていないと、錯覚してしまうことがあります。回収量で考えれば十分なのにもかかわらずです。なので、うちでは過剰に発現させてみて、上手く可溶化していないように思えても精製してみて、回収できれば＝その一部が可溶化していればOKという流れになっています。 わたしもそう思います1%くらいしか可溶画分に来てなくても、数マイクログラムあれば生化学的に問題ないですし、そのレベルならどんだけひどくっても可溶画分からタンパクとれますから。 しかし最近どうも可溶画分に来ていてもクロマト(ゲル濾過など)で変な 挙動を示すものがかっこうみられ、そういうものってかなりの確実で 何分子かがあグッてしまっているようなんです。なのでちょっと慎重に やりたいなと思ったりします。 > > 話は多少ずれますが、不見識でしたが、不溶化＝inclusion bodyと短絡的に信じ込んでいたんですが、最近のpaper見てるとどうも違うんですね。 タンパクを取るという視点では可溶画分に来てくれればいいので あまり違ってもきにしませんね。仰られていることはなんとなく わかりますが、大腸菌などでタンパクを取る時は区別はしてません。 タンパクのアグリゲーションとかはアルツハイマーやALSなど神経 系疾患でもいろいろ研究がありタンパク質の性質、周りの環境、 細胞内の生理的な作用で起こったりすることがあります。 あとは機能、構造的に正常であっても非常に可溶化が難しい フラクションが細胞のなかにはありますね。そういうフラクションは可溶化 して実験すること事態がかなり無茶なことをやっている というふうに思えてきています。

(無題) 削除/引用 No.388-11 - 2009/05/03 (日) 19:32:51 - SYBR_master >[Re:10] おおさんは書きました : > 非常にいろいろなバイチで検討をしているのがありました。あまりにも > バリエーションが多いので斜め読みではなんとも把握できてませんが、 > おそらくその辺のバイチを使ってらっしゃるのでしょうか。 いやいや、Recipesのstock solutionの中から誘導に絶対必要物だけLBに加えてsmall cultureで使用しています。でないとlarge cultureに持って行ったとき、キットを使用すると条件変わりすぎると思うので。 >最近の傾向として栄養リッチなものにして非常に高いOD値まで持っていくの >が多いみたいです。 Target proteinをいかに多く回収できるかが問われているので、高いOD=高い回収率が見込まれる、ということのようです。が、あまりpaperの内容読んでませんし分野違いで理解できていません。実際のところ使用者は目的が達成できればよいのですから(ここら辺がキットの悪い点でしょうね）。 > うーんやはりこの辺一般的にいわれているのとかわりがないのかなぁ。 書き方悪かったですね。pelletの量に目がいってしまし、supernatantには少ない=上手くいっていないと、錯覚してしまうことがあります。回収量で考えれば十分なのにもかかわらずです。なので、うちでは過剰に発現させてみて、上手く可溶化していないように思えても精製してみて、回収できれば＝その一部が可溶化していればOKという流れになっています。物が取れないより取れれば研究進みますし、可溶化の条件設定・改善で別のpaper書けるようなので、可溶化条件設定は目的が達してから、暇を見てという流れです。今のところ回収できない物には出合っていないのですが、たまたまかもしれません。あ、あと、膜タンパク発現は今のところ避けています。 話は多少ずれますが、不見識でしたが、不溶化＝inclusion bodyと短絡的に信じ込んでいたんですが、最近のpaper見てるとどうも違うんですね。現在取っているタンパクもどうやら発現させすぎで、in vivoもしくはin vitroでaggregationを起こしているのではないかと、直近のデータ見ながら思っています。

(無題) 削除/引用 No.388-10 - 2009/05/02 (土) 10:34:05 - おお >[Re:9] SYBR_masterさんは書きました : > > 1個人的には培地組成が細かすぎて試薬作るの面倒だった（持ってない試薬も多々あった）ので、いくつかのパイロット実験組んで比較した点においてのみ、簡便法を組んで使用しています。small cultureに使うにはキットは高いんで。 非常にいろいろなバイチで検討をしているのがありました。あまりにも バリエーションが多いので斜め読みではなんとも把握できてませんが、 おそらくその辺のバイチを使ってらっしゃるのでしょうか。 M9やLBでも報告が見られています。もうチョット見ていこうかなって おもいます。最近の傾向として栄養リッチなものにして非常に高い OD値まで持っていくのが多いみたいです。 > > > 発現量や可溶性が上がるというのはうれしいですね。 > > 発現量は格段に上がりますね、IPTGで確認できないものが明らかにCBBで見えますから。発現しすぎて可溶性は逆に落ちる様に見える物もありますよ。 うーんやはりこの辺一般的にいわれているのとかわりがないのかなぁ。

(無題) 削除/引用 No.388-9 - 2009/05/01 (金) 20:04:26 - SYBR_master > Autoinduction Systemって言うんですね。 いや、製品名の略称で使っているのですが、今検索してみたら開発者もこの名前で呼んでますね。 > ゆっくりと見ていこうと思います。どうやら1980年後半 > にその試みについて報告があるようです。 > 多分それから久しく使われてなかったような感じです。 1980年代後半のはたぶん"T7 exprssion system (pET vector & T7 pol)"の開発ですね(読んでませんけど)。その後1998年に、T7 lysozymeがあっても起きているleaking expressionを抑える研究のさなか、IPTG無しで勝手に発現してくる現象が見られて、その後それをpET vectorの開発者が改良し、2005にoriginal paper, 2007末にRecipes and stock solutions集を公開してます。ただ、個人的には培地組成が細かすぎて試薬作るの面倒だった（持ってない試薬も多々あった）ので、いくつかのパイロット実験組んで比較した点においてのみ、簡便法を組んで使用しています。small cultureに使うにはキットは高いんで。 > 発現量や可溶性が上がるというのはうれしいですね。 発現量は格段に上がりますね、IPTGで確認できないものが明らかにCBBで見えますから。発現しすぎて可溶性は逆に落ちる様に見える物もありますよ。

(無題) 削除/引用 No.388-8 - 2009/04/30 (木) 15:09:12 - おお >[Re:7] SYBR_masterさんは書きました : > 現在ルーチンでAutoinduction System使用しています。 Autoinduction Systemって言うんですね。 おそまきながら検索などしています。 ゆっくりと見ていこうと思います。どうやら1980年後半 にその試みについて報告があるようです。 多分それから久しく使われてなかったような感じです。 > 1. 発現の条件設定不要・overnight cultureするだけ > 2. 培地選択不要・既存の培地に加えるだけ > 3. 最終収量が3-10倍稼げる > 4. smallもlargeも同条件 > 5. 可溶化も起きやすい > 発現量や可溶性が上がるというのはうれしいですね。

ルーチンで使用しています 削除/引用 No.388-7 - 2009/04/28 (火) 13:05:54 - SYBR_master 現在ルーチンでAutoinduction System使用しています。 たぶんこれも同じモンです http://www.invitrogen.co.jp/transformation/magicmedia.shtml 使用感は以下の通り 1. 発現の条件設定不要・overnight cultureするだけ 2. 培地選択不要・既存の培地に加えるだけ 3. 最終収量が3-10倍稼げる 4. smallもlargeも同条件 5. 可溶化も起きやすい 特にずぼらな私にとって1-3はありがたいし、発現量の少ない組み替えタンパクでいちいち条件設定(OD測定）が面倒だなーと思っていたので、overnight cultureのみは有り難いですね(学生には、教育の面から向かないでしょうけど）。T7 promoter以外にも当然lac/tac promoterも誘導できますので、pGEX等でも使用できます。 組成も知っており簡便法として自作もしていますが、製品として売られているので詳細書くのは控えておきます。original paperも出てますし、関連paperも沢山出ているので探してください。 Novagenの説明にもあるようにhostは選びますが、BL21をルーチンで使っている分には問題ないです。あと、可溶化促進についてはこれだけでは完全には無理なので、他の方法(培養温度等）を組み合わせることになりますね。

(無題) 削除/引用 No.388-6 - 2009/04/27 (月) 13:25:15 - おお >[Re:5] 中年さんは書きました : > T7タイプに限るわけではないようですが、ラクトースを使ってオーバーナイトで誘導を掛ける培地も市販されているようです。 > > http://www.cosmobio.co.jp/product/products_NVG_20040312.asp > > 逆に考えると、ラクトースで誘導しようとすると、IPTGのように速やかな誘導が期待できないからではないでしょうか。ラクトースオペロンの真のインデューサーであるアロラクトースは、ラクトースからβ−ガラクトシダーゼによって異性化されて生じるので、それ自身オペロンの誘導によって増加するでしょうから、誘導のキネティクスはかなり複雑になるだろうとも思われます。 あ、そうだラクトースでは直接LacIに作用しないんだ。 随分昔のことで忘れてしまってました。 たしかにカイネティクスはIPTGみたいに簡単ではないですね。 ちょっとこの辺ほじくってみることにします。 キット化されて中身が完全に分からないのでリファレンス か検索しないとバイチの組成など得られないかもしれませんね。 バイチがケミカルとして把握されたものを使っているような 感じなのでM9ベースのような気がしますね。

(無題) 削除/引用 No.388-5 - 2009/04/27 (月) 10:39:12 - 中年 T7タイプに限るわけではないようですが、ラクトースを使ってオーバーナイトで誘導を掛ける培地も市販されているようです。 http://www.cosmobio.co.jp/product/products_NVG_20040312.asp 逆に考えると、ラクトースで誘導しようとすると、IPTGのように速やかな誘導が期待できないからではないでしょうか。ラクトースオペロンの真のインデューサーであるアロラクトースは、ラクトースからβ−ガラクトシダーゼによって異性化されて生じるので、それ自身オペロンの誘導によって増加するでしょうから、誘導のキネティクスはかなり複雑になるだろうとも思われます。

(無題) 削除/引用 No.388-4 - 2009/04/25 (土) 17:48:39 - おお >[Re:3] ザンギさんは書きました : > 聞いたことはありますが．．． > > 強すぎるプロモーター活性を調節してやるのが目的だったような気がします。 私もそれを考えているのですけど、、、 たとえば、IPTGの濃度もいろいろ探ると10uM位まで下げるようなものも見かけますし、 それであったらラクトース使っても良いのかもっておもったいりするわけです。 > 試薬の値段は安いけど再現性の難しさを考えると高くつくような気もしますね。 再現性はどうなんでしょうね、、、、 たしかにどうなるか分からないところがあります。

(無題) 削除/引用 No.388-3 - 2009/04/25 (土) 16:52:38 - ザンギ 聞いたことはありますが．．． 強すぎるプロモーター活性を調節してやるのが目的だったような気がします。 試薬の値段は安いけど再現性の難しさを考えると高くつくような気もしますね。

(無題) 削除/引用 No.388-2 - 2009/04/24 (金) 11:11:36 - 困った 聞いたことありませんね。 お分かりと思いますが、ラクトースがbetaGalで分解されるとグルコースができるので、カタボライト抑制で該当プロモータからの転写が起きないのでは？自信ありませんが。 ウキペ＞＞ラクトースとグルコースが豊富に存在する場合では、カタボライト抑制によりまずグルコースが消費され、その後にラクトースが消費される。こうした培地で育てた大腸菌は、二段階増殖（2度の対数増殖期を迎える）の増殖曲線を描く。

大腸菌によるリコンビナント, ラクトースで誘導 削除/引用 No.388-1 - 2009/04/24 (金) 05:58:26 - おお 大腸菌によるリコンビナント作成でLacI/T7をつかったプロモーターの 誘導でIPTGを使いますが、ラクトースを使われる方いますか? またその理由はなぜでしょうか。

全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---