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(無題) 削除/引用 No.3872-13 - 2011/01/31 (月) 15:09:10 - 3年目 返信が遅れてしまい申し訳ございません。 皆様にご教授頂いた点を踏まえ、現在新たな抗体や試薬を 発注している段階におります。 またご相談させていただく機会があるかと思いますが、 何卒よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.3872-12 - 2011/01/25 (火) 02:51:20 - Boston-Pullman cell signaling に関わる分子の場合、kinase/phosphatase inhibitors を添加する必要があるかもしれません。 Lysis buffer を加えるまえの PBS wash もしないほうが良いかもしれません。解離してしまう可能性があるからです。 細胞密度もかなり重要です。70% と90% confluency では異なりますし、前任者の人がひそかに培地交換をして、感度を上げていた可能性もあります。 界面活性剤で問題解決できない際は、参考にしてください。

(無題) 削除/引用 No.3872-11 - 2011/01/24 (月) 22:02:42 - TS ＞本当に目的タンパク質が沈降できているかどうかにつきましては、 ＞一度、ラボのメンバーや教官に確認致します。 抗体種の組み合わせ、目的タンパク質の分子量で判断すればよい程度のことです。おそらくＩＰとＩＢに同じ抗体を使っていると推測しますが、沈降しているタンパク質の分子量が25, 50 kDa付近でなければ問題ないと思います。これがLC、HCに相当する分子量ですから。 あるいは、True blotのような二次抗体を使用しているとか。

(無題) 削除/引用 No.3872-10 - 2011/01/24 (月) 19:41:41 - 3年目 皆様、ご投稿ありがとうございます。 ウサギ 様 教官の指導の下、実験を行なっておりますが、 以前この系で成功しており、再現性を求められています。 ウサギ抗体を使っておりますので、こちらも考慮し、 実験を進めるか、考えたいと思います。 ----------------------------------------------------- ペコ 様 再現性の問題になります。IP自体は以前はキットを 用いておりません。10年近く前の実験の再現のため、 回収方法など、細かい部分で相違のある可能性があります。 今一度、確認し、検討致します。 ----------------------------------------------------- Boston-Pullman 様 IP、Totalのタンパクの比較をしており、 unbound fractionでは、発現を確認しておりません。 一度、こちらの確認も必要と考えております。 付随はユビキチンではございません。 複数のご投稿誠にありがとうございます。 ----------------------------------------------------- TS 様 ご返答ありがとうございます。 界面活性剤の選択としては、間違いないと考えております。 濃度が高いとのことですので、少し下げるよう検討致します。 抗原抗体反応は通常O/Nで行なっております。 強制発現につきましても、実行の価値を見出しています。 本当に目的タンパク質が沈降できているかどうかにつきましては、 一度、ラボのメンバーや教官に確認致します。 -----------------------------------------------------

(無題) 削除/引用 No.3872-9 - 2011/01/24 (月) 18:47:43 - Boston-Pullman 付随ってユビキチンのことではないでしょうね？

(無題) 削除/引用 No.3872-8 - 2011/01/24 (月) 18:21:03 - TS 念のため１つだけ確認ですが、 本当に目的タンパク質が沈降できているのですよね？ IP-IBでスメアになる、というところを思い出しましたが、 免疫沈降に用いた抗体のHCやLCを引っかけているわけではないのですね？

(無題) 削除/引用 No.3872-7 - 2011/01/24 (月) 18:17:54 - TS バッファーを変えたり、試行錯誤をしているのですね。 私は、共免疫沈降時の界面活性剤としてTritonやNP-40あたりの中性のものが好きで（デオキシコール酸やSDSなどの陰性のものは怖い）、〜0.5%くらいでうまくいかないのであれば、マイナーチェンジしても、大きな改善は期待できないような気がします（１％は少し高めの印象が）。 プロテアーゼインヒビターは必須だと思います。 抗原抗体反応はどのようにやっているのでしょう？ １−数時間という場合が多いかと思うのですが、オーバーナイトで粘る、ということもありかと。私は、ルーチンではO/Nです。ノンスペなどが気になるときに短くする、と言う感じで。 いろいろ可能性はあるのでしょうが、 実はタンパク質AとBは複合体を形成しない（３年目さんの系では）、相互作用が弱いなどのため検出が難しい、などを考えるところです。 どうしてもIP-IBで攻めたいのであれば、 私も強制発現系で攻めるのは有りだと思います。 また、クロスリンカーに挑戦する手もあるとは思います（個人的には、結果の判断が難しいのでやりませんが）。 蛍光免疫染色で共局在を示し、共発現系との結果と併せてお茶を濁す（笑）。 ごちゃごちゃ書きました、すみません。 なかなか難しいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.3872-6 - 2011/01/24 (月) 13:15:19 - Boston-Pullman IP後のunbound fractionには共沈して欲しかったたんぱく質が残っているのでしょうか？ ちなみにウサギのポリクロでも、Dynabeads-proteinGで問題なく免沈出来ています。 サンプル調製時の遠心はしたほうがよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3872-5 - 2011/01/24 (月) 13:13:27 - ペコ >目的のタンパクの抗体では発現が確認できていますが、 >それに付随してくるはずの別のタンパクの発現がありません。 付随してくるとはどういう根拠ですか？ 再現性の問題？ 細胞の違い？ 複合体をなすという報告があるということへの信頼？ まあ、手っ取り早く両者を過剰（もしくは相手方のタンパク質を過剰発現）させて、そこからIPで示しつつ、なんとか強引に内因性のCO-IPも検出できたらいいな、という感じで私なら進めますかね。

(無題) 削除/引用 No.3872-4 - 2011/01/24 (月) 12:45:29 - ウサギ それ、一般的にたいへんです。 IP-Westernにあまり再現性がない（とくに違う研究室で）のは有名な気がします。 定量的に、１−１０％のIPの効率でも検出できるようなゲルへの乗せ方をしないといけません。 １％のIPの効率でも検出できるようなやりかたって、実際やってみるとかなり難しいです。 （ウサギ抗体を使っているなら、ProteinGとウサギ抗体は相性があまりよくないのは知っていますか？）

(無題) 削除/引用 No.3872-3 - 2011/01/24 (月) 12:26:33 - 3年目 TS　様 早々のご投稿ありがとうございます。 Co-IPのトラブルで相違ございません。 ミリポア社のRIPA Lysis Buffer, 10Xを用いております。 組成は0.5M Tris-HCl, pH 7.4, 1.5M NaCl, 2.5% deoxycholic acid, 10% NP-40, 10mM EDTA. 上記をMQで1Xにし、さらにcomplate mini EDTA tabletを 加えておりますが、不要でしょうか。 また、1％TritonX，PBSのBufferを試みましたが、 RIPAと同じような結果となりました。 以上を踏まえ、再度ご指導頂ければ幸いです。 よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.3872-2 - 2011/01/24 (月) 12:17:00 - TS >目的のタンパクの抗体では発現が確認できていますが、 >それに付随してくるはずの別のタンパクの発現がありません。 >IP前のTotalタンパクでは発現しています。 Co-IPがうまくいっていない、というトラブルでしょうか？ RIPAバッファーの組成によっては、タンパク質複合体がはずれてしまうと思いますが、どのような組成なのでしょう。 >また、IPを行った方のWesternのバンドは >全体的に縦に伸びたような形をしておりますが、 >IP後としては問題ないのでしょうか。 発現量（沈降量）が多ければ、すこしスメア気味にはなるかもしれません。

IP（免疫沈降）後のWesternでバンドがでない 削除/引用 No.3872-1 - 2011/01/24 (月) 12:01:40 - 3年目 いつも勉強させて頂いております。 現在、初めてIPに挑戦し、その後、Western blottingを行い、 バンドの発現を確認しております。 目的のタンパクの抗体では発現が確認できていますが、 それに付随してくるはずの別のタンパクの発現がありません。 IP前のTotalタンパクでは発現しています。 実験の系としましては、 タンパクをRIPA Lysis Bufferにて溶解後、遠心、 上清のみを回収し、IPを行なっております。 IPにはInvitrogenのProteinGキットを用いており、 抽出は還元する方法を選択しています。 回収時に問題があるのではないかと考えており、 Bufferや溶解の時間を変更しましたが変化がみられません。 現在、サンプルを遠心せずIPを行うことを検討中です。 また、IPを行った方のWesternのバンドは 全体的に縦に伸びたような形をしておりますが、 IP後としては問題ないのでしょうか。 以上につきまして、ご教授頂ければ幸いです。 何卒、よろしくお願い申し上げます。

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