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(無題) 削除/引用 No.3869-8 - 2011/01/29 (土) 10:02:11 - とも 774様、masa様、コメントありがとうございました。 コメントを参考にして、DNAを二本鎖にする行程から、10倍希釈物と100希釈物を追加してやり直しました。 コロニー数がこのようになりました。 10希釈：ネガコンの3倍以上 100希釈：ネガコンの20倍以上 一先ず、安心しています。

(無題) 削除/引用 No.3869-7 - 2011/01/26 (水) 12:51:35 - masa 774さんもおっしゃられていますが、制限酵素処理後の突出末端になるように設計したoligoDNAをアニーリングするのが簡単です。制限酵素の認識配列が配列の末端にあると切断効率が落ちる酵素がかなり存在しますし、普通のプラスミドよりも濃度辺りのモル数が高くなるので処理時間も難しいと思います。 oligoをアニーリングする時には溶液中のoligoの濃度や、塩濃度が効率に影響します。詳しくはshRNAの発現ベクターなどの説明書を読まれるといいと思います。ライげーションする際の比率等も記載されています。精製のステップは行わないので電気泳動等での濃度確認は不要だと思います。 またベクターを脱リン酸化処理されていますが、oligoには末端にリン酸化処理をされたものを用意されていますでしょうか？されていないものであれば自分でリン酸化する必要がありますので確認されるといいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3869-6 - 2011/01/26 (水) 11:18:19 - 774 >ちなみに、私は「インサートの濃度が薄いから」ではないかと考えています。 何ともコメントが難しいところですが、逆にインサートの濃度が高すぎた可能性はないでしょうか？ ベクターとインサートのモル比が1：2-3くらいがベストだと習いました。 それぞれの長さ（分子量）の比と電気泳動のシグナルの強さの比を考えてみて下さい。 （DNA量の見積もりがアガロース電気泳動じゃなかったらごめんなさい。） オリゴ合成するときに、アニールさせるだけで突出末端ができるようにデザインすると楽です。 5　----------　3 3　 ----------　5 こんな感じです。

(無題) 削除/引用 No.3869-5 - 2011/01/26 (水) 11:04:16 - とも プラスミドを制限酵素でチェックしたところ、全滅（0/10）でした。 ネガコン（CIP処理したベクターのみ）と同じくらいしかコロニーがなかったので、その時点で怪しかったのですが。。。 50 bp位のDNA断片をクローニングするのは初めてなので、経験がある方教えてください。 ちなみに、私は「インサートの濃度が薄いから」ではないかと考えています。 宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3869-4 - 2011/01/25 (火) 02:38:12 - 通りすがりの学生 FOPFlashの作成もお忘れなく。。。

(無題) 削除/引用 No.3869-3 - 2011/01/24 (月) 18:52:49 - とも 通りすがりの学生様 コメントありがとうございます。 そのような方法は知りませんでした。 自作の理由は節約ですが、購入した方が確実ですね。 既に、Tcf/Lefの結合配列を含んだDNA断片の合成を注文しました。 これから、以下のように自作したいと考えています。 �@二本鎖DNAにする �A末端を制限酵素で処理する �Bベクターにクローニングする １回でうまくいけばよいのですが。。。

その前に 削除/引用 No.3869-2 - 2011/01/24 (月) 17:23:35 - 通りすがりの学生 Addgeneで送料込みで1万円くらいで手に入りますが、あえて自作されようと考える理由は何でしょうか？ http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&cmd=findpl&identifier=12456

TOPFlashを自作 削除/引用 No.3869-1 - 2011/01/23 (日) 11:46:05 - とも TOPFlashのようなWntレポーターを自作したいと考えております。 自作された方がいらっしゃいましたら、その方法を教えてください。

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