そもそも発現株の構築であれば条件検討をするのは当然で、
>全く意味のない実験
も中にはあることを受け入れる必要があると思いますけど。
緑と白のコロニーの@ベクター配列とAタンパク質の質や量等のどちらが問題なのかが分かれば問題解決ですよね。
@ミニプレップ→制限酵素処理→電気泳動や、コロニーPCR→電気泳動で、両者にインサートが入っているかは再度確認できますよね。
緑コロニーにインサートが入っていないのか、白コロニーが無関係なベクターが入ったものなのかが分かります。ここで両者に違いが無ければ、株ごとの発現量の差なのでしょう。
A緑と白のコロニーを増やしてタンパク質を回収し、SDS-PAGE。同じタンパク質を発言していても、白コロニーでタンパク質量が少ないのであれば、確認できます。
@の確認をしていなくても、アミノ酸が100bp分（約33アミノ酸分）増えていれば、SDS-PAGEで流せばサイズの違いが分かりますよね。
774さんのWBというのもこの意味かと思います。（発現量が十分であれば、WBでなくCBB染色で見れるはずですが）
>そうなると、シークエンスもうまくいかないのでは・・
貴方の腕が分かりませんので、シークエンシングの際には当たりのベクターを使っていて、その後でコンタミした可能性が否定できるか不明です。
シークエンシング時に既にコンタミしていたが、その量が微量だったためにメインの当たりのピークに隠れていたのかもしれません。
また、大腸菌の発現株でタンパク質を作らなくなるものが出てくるのは珍しくないので、貴方の操作には全く問題なく、たまたま発現しない株が見えているだけなのも否定できません。 |
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