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(無題) 削除/引用 No.386-17 - 2009/04/30 (木) 19:54:07 - AP 試薬のロットが悪いのに当たったとか、試薬の回転の関係で保存期間が長くなった棚卸し直前の試薬にあたったとか、機械が調子悪かったとか、何かの拍子で合成エラーは起こりやすくなるみたいですね。いかにちゃんとした会社でこれまで問題がなかったからといっても、いつそういうことが起こるか分からないです。業者さんの方もそういうことがあるのは了解しているので、 >２、一つのプライマーセットに関しては、後日同じものを再度合成し直しクローニングし直した。 こういう場合、追加料金なしで合成し直してくれるところが多いと思います（カチョーさんの場合もそうでしたか・）。メーカとしても合成システムのチェック、不調の疑いを指摘してもらったくらいの感覚なんじゃないでしょうか。そうするとテストもかねて慎重に合成・検査してから出荷してくれるようで、たいてい解決しますけれど。もし、それでもおかしかったら、違うメーカーに頼んでみますね。今だと合成エラーでヌクレオチド組成が違うものが混じっていても、MASSなんかで簡単に検査できるので、QCとして納品前にそういう検査をしているメーカーを使うと安心です。

(無題) 削除/引用 No.386-16 - 2009/04/30 (木) 18:46:48 - るる 私もプライマー合成不良と思います。 私も主に一つの会社を使い続けていますが、プライマー合成不良はまれに有ります。クレームを出して同じ配列を作り直して貰うと、（その会社は）大抵は良くなります。 ご説明のあったプライマー達、問題のプライマーと同日に同じ機械で作ったとは 限らないと思いますので、カチョーさんもプライマーを作り直してみたら（作り直して貰ったら）いかがですか？

(無題) 削除/引用 No.386-15 - 2009/04/30 (木) 17:53:59 - カチョー ありがとうございます。プライマー合成に関して説明を付け足させてください。 １、変異部位以外の配列は同じであるプライマーを数セット用いた。 ２、一つのプライマーセットに関しては、後日同じものを再度合成し直しクローニングし直した。 ３、以上のように複数のプライマーを試していることに加え、これまで同じ会社を使い続けているが 合成エラーの入る頻度は極めて低かった。このトピックでの手法を用いた変異導入を行う際（今回とは全く別の実験）でも問題はなかった。 上記の理由から、PCRでのエラーに疑いをもちました。この配列が何らか合成エラーが入りやすいようなものである可能性も否めませんが・・。

(無題) 削除/引用 No.386-14 - 2009/04/30 (木) 15:32:01 - AP >最近のプライマー作成精度を考えればプライマーエラーではないと思いますし、 プライマー部分にだけそういうことが起こっているのだから（たとえ最終的にはPCRで誘発されたとしても）プライマーに原因があると考えるのが妥当でしょう。一般論として合成精度が上がっているということだけを根拠として、そこは問題ないはず、と結論するのもサイエンティストらしからぬ、、と思いますが。 実際、合成エラーや低精製度で起こる問題は割とありがちです。価格競争が激しくなっている中で、品質はメーカーによってかなり違うと感じます。精製システムや精製度はメーカーによってバラバラみたいですし、同じ合成機を使っていても、メンテナンスが悪いとことや扱う人のスキルが低いところだと、何が起こってもおかしくないです。

カチョー様 削除/引用 No.386-13 - 2009/04/30 (木) 13:41:45 - 雑兵 それはプライマーの脱保護が不十分であるせいで起こると聞いたことがあります。 オリゴヌクレオチド合成機は、合成反応の都合上、塩基部分に保護基を付けた形で合成を進めるため、全長の合成が終わった後にカラムから切り出した保護基付きのオリゴヌクレオチドをアンモニア水と加熱することでこの保護基を外す脱保護の必要があります。この反応が不十分だと、PCR産物として大腸菌に入った後に、菌のDNA修復機構によりおかしな修飾塩基として認識され、修復が起こって変異が導入されてしまうというものです。 オリゴ合成の依頼先に文句を言ってみたらどうでしょう。

プライマー部分へのPCRエラー 削除/引用 No.386-12 - 2009/04/30 (木) 12:42:31 - カチョー この方法でよく変異導入を行っていたのですが、プライマー領域に必ず変異が入る、という事態に遭遇しました。同じ部位で種々のアミノ酸置換を行っており、変異導入配列以外は全て同じプライマーシリーズを用いているのですが、クローニング後にシークエンスをチェックすると、どれもプライマー部分に変異が見られました。それも、それぞれ違う箇所にです。数種類作っているので、最近のプライマー作成精度を考えればプライマーエラーではないと思いますし、PCR中に何かおかしなことになったに違いないのですが、よく理解できません。どなたか同じような経験、もしくは原因をご存知の方、お願いします。

(無題) 削除/引用 No.386-11 - 2009/04/25 (土) 02:25:03 - ピクル うちのラボでは「乗り換えPCR」といってます。 ラボの外人は「juncture PCR」という表現を使ってました。

(無題) 削除/引用 No.386-10 - 2009/04/24 (金) 14:47:24 - おお ちなみにdouble jointing PCRといって3ッつのフラグメントをつなげる 方法もあるようです。

(無題) 削除/引用 No.386-9 - 2009/04/24 (金) 12:01:22 - PCR >あべちゃんさん プロトコールありがとうございます。 少し意味が分からない場所があるのですが、 変異導入用プライマー=MUTプライマーですか？

(無題) 削除/引用 No.386-8 - 2009/04/24 (金) 11:50:49 - あべちゃん >[Re:1] PCRさんは書きました : 、 > 具体的なやり方分かりません。やったことある人がいたら、 > プロトコールなど教えていただけませんか？ TAKARAのサイトにこんなのがあります。 http://catalog.takara-bio.co.jp/product/tech_info_detail.asp?catcd=B1000345&subcatcd=B1000348&unitid=U100003401&masterid=M100002708 和文なので取っつきやすいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.386-7 - 2009/04/24 (金) 11:19:07 - おお I thought PCR wrote "jointing". Joining PCR.... Did I describe something else?

(無題) 削除/引用 No.386-6 - 2009/04/24 (金) 10:57:24 - taka 非特異的な増幅や増幅がイマイチな場合、プライマーなしで数サイクル回してからプライマーを加えて残りのサイクルを回すことで、改善したことがありました。

(無題) 削除/引用 No.386-5 - 2009/04/24 (金) 10:41:39 - AP 原理的には同じですが、おおざっぱに二通りの方法があると思います。 ひとつは、オーバーラップする鋳型（PCR産物の場合は精製＝プライマー除去をしておく）をまぜて、つながったときに両端になる配列のプライマーを入れてPCRをかける方法、もう一つはオーバーラップする断片だけで何回かPCRをかけたものを鋳型にしてプライマーを入れてPCRする方法です。 >やったことないので、どこかにプロトコールがあればいいなあと思ったのですが、やっている人少なそうですね。 いや、ルーチンに使われる方法で、特殊な手技が必要ではなく、普通のPCRの道具立ててできますので、それ用のプロトコールを、といわれても出てこないんじゃないですかね。どうしてもとおっしゃるなら、site-specific mutagenesisの手法の一つとして、Molecular Cloning 3rd ed. (Chapter 13, protocol 6 Site-specific mutagenesis by overlap extension）やCurrent protocols, Short protocolsなんかに載っていますのでそれをご覧ください。

(無題) 削除/引用 No.386-4 - 2009/04/24 (金) 09:44:00 - Pumpkin Joining PCRという名前は初めて聞きました（お恥ずかしい）。おおさんがおっしゃている方法であれば、overlap PCRと言っていました(す）。任意の1点（近接すれば複数）に変異を入れたいときに、オーバーラップする配列に点変異かカセット変異を入れたPCR断片を2つ用意して、それぞれのオーバーラップしない下端のプライマーを入れてPCRをかけるとオーバラップした位置に変異を入れたPCR断片が手に入ります。これでプロモーターアッセイや蛋白質のアミノ酸置換などをやっていました。こういうことですかね？もちろん、1つの遺伝子でいくつかの断片として取ってきたものを1つにつなげるというときにも使えます（もちろん、オーバーラップ部分があればですが）。 つまり、オーバーラップする配列をもつ断片2つと、増やしたい領域をカバーするプライマーセットで普通にPCRをかけるだけですね。

(無題) 削除/引用 No.386-3 - 2009/04/24 (金) 09:35:14 - PCR >おおさん なるほど。面白そうな方法ですね。 やったことないので、どこかにプロトコールがあればいいなあと思ったのですが、 やっている人少なそうですね。 サイクルは普通に30くらいでやっても問題ないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.386-2 - 2009/04/24 (金) 09:24:17 - おお 方法の性質状いろいろいじってオプティマイズできるところはあるかもしれませんが、原理的には2つのオーバーラップするDNAフラグメントと両はしのプライマーをまぜ普通にPCRするのという方法だったと思います。 昔はクレノーなどのポリメラーゼでやってたこともあったと思います。 増幅しないので最初の量が多く必要かもしれません。

Joining PCR 削除/引用 No.386-1 - 2009/04/24 (金) 05:43:02 - PCR ふたつのPCR産物をつなげて一つにすることができるという joining PCRという方法があると聞いたのですが、 具体的なやり方分かりません。やったことある人がいたら、 プロトコールなど教えていただけませんか？ よろしくお願いします。

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