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(無題) 削除/引用 No.3855-7 - 2011/01/24 (月) 19:23:24 - 匿名 実際のところ4% PFAで固定するのみで細胞がleakyになることはよくあります。詳細なメカニズムは知りませんが。 そのような場合に細胞表面の分子を検出したい時は、無固定の細胞を抗体染色することにしています。 細胞表面に結合した抗体のインターナリゼーションが問題になることがありますが、低温で、あるいはアジ化ナトリウム存在下で抗体とインキュベートすることで、その反応は低く抑えることができます。細胞の形態保持のために固定が必要な場合は、1次抗体の洗浄が終わってから固定してそれ以降の染色を行うことも出来ます。

(無題) 削除/引用 No.3855-6 - 2011/01/21 (金) 19:37:09 - kako もちろんPFAにメタノールが混じってたなんていう落ちはないと思いますが、PFAが古くて、一部が膜に穴を開けるような物質に変化したという可能性でしょうか。新しくても、溶かすときに熱したりいろいろとやるので、変化してもおかしくはないと思います。私も昔、そんなことがあったような気がします。

(無題) 削除/引用 No.3855-5 - 2011/01/21 (金) 13:45:56 - すぶりをするそぶり ああ、ネガコンについては既に検討ずみのようですね。 失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.3855-4 - 2011/01/21 (金) 13:42:12 - すぶりをするそぶり >ところが、透過処理をしていないにも関わらず、 >細胞内、特にゴルジに蛍光シグナルが認められました。 >これはPFA固定だけでも細胞内に抗体が入ってしまった、ということなんでしょうか？ バックグラウンドレベルの蛍光シグナルを拾っているということではないのでしょうか？ 抗体を加えていないネガコンサンプルを同条件で観察してみては？

(無題) 削除/引用 No.3855-3 - 2011/01/20 (木) 19:58:24 - GLUT ンンノ様 コメントありがとうございます。 >表在性のターゲットに結合した抗体が、ターゲットごと細胞内に引きこまれた んではありませんか。 4 % PFA/PBSで30 min, 室温で固定しておりますので、基本的には細胞はすでに死んで（固定）しまっており、endocytosis等の細胞の営みは止められているだろうと考えておりますが、この見識に問題ありでしょうか？固定後も表面に結合した抗体が細胞内に引き込まれる例を私は存じあげておりませんが、もしそうだとしたら固定法を変える等すべきなんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3855-2 - 2011/01/20 (木) 19:27:14 - ンンノ 表在性のターゲットに結合した抗体が、ターゲットごと細胞内に引きこまれた んではありませんか。

透過処理せず、PFA固定のみでも細胞内が染まる 削除/引用 No.3855-1 - 2011/01/20 (木) 15:03:11 - GLUT 大変お世話になっております。 現在、ある刺激下で見られる分子（トランスポーター）の局在の挙動を免疫染色により確認しております。サンプルは培養細胞株で、ある分子のC末にHAタグを付け、安定発現させております。（このタグ付きタンパク質はトランスポーターとして機能的に働くことは以前の報告により確認されております。） 検出は、抗HA抗体を使用しており、parentalな細胞はこの抗体では全く染まりません。 蛍光標識二次抗体を使用し、confocal顕微鏡にて観察しております。 刺激により染まる様子は異なるのは確かなんですが、どの程度細胞膜にそれが現れるのかが、comfocalでもってしてもあいまいです。（HAタグは細胞内領域になりますので、FACSでの検出は行っておりません。） というのも、このタンパク質はゴルジと細胞膜をtrafficしており、4 % PFA/PBSにて固定後、0.02 % Triton-X100で透過処理してblocking後、染色操作を行うと多くが細胞内のゴルジと思われるところに集積しております。刺激するとそのパターンも変わるようなんですが、いまのところそういった主観的な観察しかできておらず、今後は細胞膜マーカーとの共染色により観察していく所存です。 そこでみなさまにお聞きしたいことがあります。 細胞膜にあるトランスポーターを検出するため、4 % PFA固定後、透過処理なしで、抗体染色しました。この際に使用した抗体はそのトランスポーターの細胞外領域を認識するポリクロを使用しております。parentalな細胞はこの抗体で染まりませんので、見ているシグナルは特異的なものと考えております。 ところが、透過処理をしていないにも関わらず、細胞内、特にゴルジに蛍光シグナルが認められました。これはPFA固定だけでも細胞内に抗体が入ってしまった、ということなんでしょうか？ こういったことはこれまで経験したことがございません。そもそも免疫染色自体それほど数をこなしてきたわけではありませんので、このようなことは十分起こりえることなのかにつき、みなさまのご意見を頂けますと幸いに存じます。 どうぞ宜しくお願いいたします。

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