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(無題) 削除/引用 No.3853-4 - 2011/01/20 (木) 16:50:00 - 蜷森 タンパクは核内タンパクで細胞はセルクレイパーで回収後、ホモジナイズをおこなっております。 やはりHisーtagにそれほどの特異性はないということですか・・・・ お返事ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3853-3 - 2011/01/20 (木) 02:06:01 - ab COS7細胞で不溶性画分ということですが、細胞の溶解に問題がある気がします。 目的のタンパク質は本来どこに局在しますか（シグナルペプチドはありますか）？ 細胞の溶解には何を使っていますか？ たまに、輸送に失敗してゴルジに蓄積される場合もありますが、その場合はシグナルペプチドを変えれば改善する事もあります。 精製後の目的タンパク質以外のバンドは、His-Tagを使っている以上仕方がない気がします。 溶出条件を変えてうまくいったのなら、それでよと思います。 いずれにしても、COS7細胞とHis-Tagの相性ではなく、実験条件の問題ではないかと思います。

すみません各途中で投稿してしまいました。 削除/引用 No.3853-2 - 2011/01/19 (水) 23:01:39 - 蜷森 　今月中にpCCAGS-vectorに目的の遺伝子+HIS-tag（3'側）を入れCOS７細胞を使ってタンパク発現を行っていました。 　目的のタンパク自体はかなり不溶性画分に持って行かれましたが精製後にＣＢＢ染色で有る程度みれるくらいは回収できました。 　しかし、目的タンパク以外のタンパクのバンドが６−７本くらい存在していました。 　トランスフェクションの最適化、および精製条件の検討の結果（高塩濃度Bufferで抽出するとき、目的のタンパク以外のタンパクがほとんど300mMで抽出されたのですが、目的タンパクは400mM以上で抽出されたので３００ｍＭ抽出後→６００ｍＭで抽出）によってきれいにとれたのですが、COS7とHIsタグが相性が悪いという話をネットで検索してもヒットしてきませんでした。 　どなたかCOS7でHIsタグ融合タンパクを発現したことがある方、もしくわこの二つの相性が悪いという話を聞いたことがある方がいたら経験談をお話頂けませんでしょうか？ 　よろしくお願いします。

タンパク発現におけるCOS7cellとHis-tagの相性について 削除/引用 No.3853-1 - 2011/01/19 (水) 22:52:31 - 蜷森 今月中にpCCAGS-vectorに目的の遺伝子+HIS-tag（3'側）を入れCOS７細胞を使ってタンパク発現を行っていました。 　目的のタンパク自体はかなり不溶性画分に持って行かれましたが精製後にＣＢＢ染色で有る程度みれるくらいは回収できました。 　しかし、目的タンパク以外のタンパクのバンドが６−７本くらい存在していました。 　トランスフェクションの最適化、および精製条件の検討の結果（高塩濃度Bufferで抽出するとき、目的のタンパク以外のタンパクがほとんど300mM）、

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