始めのGCリッチだからという話がコドンの使用頻度に変わっているような気がしますが。
>大腸菌のコドンUsageとこの外来種の酵素のコドン使用頻度を照合することで、大腸菌で多様されるtRNAの修飾塩基が変わることで、タンパク合成において大きく影響がありますよね。
この文では「照合」と「変わること」はどういう位置関係にあるのでしょうか？
照合の後に変わるというのであれば、貴方が照合さえしなければ大腸菌内での修飾が変わらないのでしょうか？
「よね」と同意を求められても、よく意味が分からないので同意できません。
>その外来種酵素は大腸菌のなかでは転写翻訳には向かないと判断しました。
判断の根拠は何でしょうか？最初に書いた低発現、低活性の確認の際のデータでいえるのかもしれませんが、書かれている情報だけでは判断できないと思います。
予想くらいに留めておいてはいかがでしょうか。
原因が判断できるのは、問題点を同定できたときでしょう。
>翻訳の確認としてウェスタンをやる予定です。
予定？
低発現であったと書いている以上、翻訳産物（タンパク質）量の確認はすでに終わっていますよね。
翻訳だけではなく転写量の確認もしたいというのであれば、これから行なうのはノーザンではないでしょうか。
また、それよりも、
>コドン使用頻度
の違いが原因だと判断したのであれば、
@アミノ酸配列を変えずに大腸菌で使用頻度の高いコドンに置き換えた発現ベクターを作製
Aそれを大腸菌に入れた際の発現量が大腸菌由来遺伝子と同等であるかを評価
するのが、原因の同定と解決に繋がるのではないでしょうか。 |
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