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(無題) 削除/引用 No.3837-7 - 2011/01/18 (火) 09:19:19 - ぼん TSさん。色々と勉強になります。 緩やかな条件とかに振ってみて、いいバランスを探したいと思います。 うまくいった、あるいはまた困り事が見つかった際はご相談させていただくかもしれません。 有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.3837-6 - 2011/01/18 (火) 02:00:56 - TS 最初に剥がれてくるのは形態的にも理解しやすいと思うのですが、上皮細胞です。ですから、剥離率をそれほど求めずに、上皮細胞を比率高くとってきたいのであれば、緩やかな条件が良いかもしれません。 顕微鏡で見たときには、つるつるというほど、きれいにとれているようには見えないです。どちらかといえば、ぼろぼろってところですね。 クリプトの形は見えるけど、絨毛は崩れている、というところでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3837-5 - 2011/01/18 (火) 01:37:48 - ぼん 色々ご指導有難うございます。 一応、ある程度細胞成分が遠心で落ちてきますので、それなりにはがれては来ていると思っております。 成程、顕微鏡で見るのは有用そうです。絨毛が取れて、ツルツルになっているはずなのですね？ わかりました。死細胞の比率が多いようなら、振り方を変えて時間を長めにしてみます。なお、この場合EDTAの時間も長めにしたほうがよいのでしょうか？ GFPについては免染ではしっかり目的の細胞に出ております。免染で見えるくらいなら、FACS出来るはずだ、と言われているので、頑張りたいところです。。。

(無題) 削除/引用 No.3837-4 - 2011/01/18 (火) 01:11:32 - TS 状況としては、とりあえず細胞はかなり剥がれていますよね? (遠心分離すると、かなり集まりますね?) でもボルテックスではやっぱり死ぬと思います。成体の消化管上皮の細胞は、Viabilityの高いまま剥離するのは簡単ではありませんので。 死んでいることが問題であれば、条件をすこし緩やかにして、トリパンブルーとかで生細胞率を高くできるように調整していくと良いと思います(振り方と時間を)。剥離率と生存率のバランスの良いところを狙っていけば。 たとえば、EDTAでゆるやかに振っているだけでも、Villiあたりの上皮であれば剥がれてくると思います(クリプトは難しいでしょうが)。 上皮細胞がどのていど剥離できているかどうかは、剥離後の残った組織片を顕微鏡で見れば判定できますよ。 ちなみに、ほかの手法（免疫染色とか）ではGFPが確認できているのですよね。

(無題) 削除/引用 No.3837-3 - 2011/01/18 (火) 00:46:51 - ぼん TSさん。 早速のレスポンス有難うございます。 提示した情報が足りなかったですね。。。申し訳ありません。 内分泌細胞とは違うのですが、同じくらい少ない種類の細胞に特異的に発現する遺伝子にGFPをノックインしたマウスからの腸管を検体としております。なので、仰る通り消化管のごくわずかな細胞群にのみしかGFPは発現しておりません。 FACSの機械そのものに不慣れですので、十分な解析とは言えないのですが、どうもGFPの強度でわけようとしても、あまりそれと考えられるpositive群が認められず、negativeに使っているWTマウスと比較してもGFP(+)がいないように見えるのです。 ご指摘の通り細胞が死んでしまっているのかもしれません。 原因はボルテックスでの撹拌が障害を与えすぎるということでしょうか？ 当初は激しくピペッティングをしていたのですが、あまり細胞成分がとれないので、ボルテックスしておりましたが・・・

(無題) 削除/引用 No.3837-2 - 2011/01/18 (火) 00:31:39 - TS 消化管上皮の一部の細胞がGFPを発現しているということでしょうか? (内分泌細胞とか。。) 粘膜固有層のリンパ球なんかだとまた少し話が違ってくると思いますが、 上皮であれば、今のプロトコールで少なくとも剥離できると思うのです。 ですので、GFP陽性細胞が検出できない原因を考えた時、 上皮が剥離できていないのではなく、剥離できているけど、細胞が死んでしまって、GFPが漏れてしまって検出できていないとか。 消化管上皮細胞の分離が難しいといわれるのは、 Viabilityを維持したまま分離することが難しいとか、リンパ球や繊維芽細胞との分離が難しいとかいうことであって、FACS解析を目指して剥離してくるだけであれば、それほど難しいものではないと思いますよ。 もう少し状況が分かると良いのですが。

消化管上皮のソーティング 削除/引用 No.3837-1 - 2011/01/17 (月) 22:51:44 - ぼん まだまだ駆け出しの研究者です。 今回消化管上皮細胞の単離および培養を目標としております。 GFPを導入した細胞なので、それを用いたFACSを考えているのですが、過去の文献に従って下記プロトコールを行っておりますが、なかなかGFP陽性細胞を拾ってこれません。GFPを発現しているとはいえ非常に小さいpopulationである、という問題はあるものの何とか取ってきたいと悩んでおります。 上皮細胞の分離がなかなか難しいと思うのですが、どなたかご存知の方がおられたら、ご教授いただければうれしいです。 よろしくお願いいたします。 �@腸管に縦切開を加えて開き、良く洗浄 �A腸管を細切れにして4℃の2mM EDTA・PBS中でincubate 30分。 �BEDTAを破棄。4℃のPBSを注入し、ボルテックスで撹拌。破棄。 �CさらにPBSを入れて、撹拌。70μmのcell strainerを通して溶液を採取してFACSの機械にかける。

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