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(無題) 削除/引用 No.3834-3 - 2011/01/17 (月) 21:47:12 - mi >APさん 早速の御回答ありがとうございます。 >どうしてもsemidry electroblottingじゃなきゃいけないんでしょうか semidry で行ったのは、D. Bartel やV. Ambros 、Current protocol などのプロトコルを参照したところ、皆semidry で行っていたからです。 Hybond-NXを用いたのもBartel のプロトコルに準拠しています。 ラボでRNAがほとんどワークしていないので、四苦八苦おり、アドバイス非常に助かります。 一度capillary blotを試してみたいと思います。 ところで、 ＞補足されづらく吸着力の弱い低分子RNA とのことですが、 300mA, 1hr での転写が不十分という可能性はあるのでしょうか？ 何分、非常に微量な内在のブロットを試みているため、転写条件がかなりナイーブなのではないかと思っています。 論文によっては、3時間ほど、semidry で転写したという記述もあります。 20nt程度のRNAの場合、どの程度で転写されるものなのでしょうか？ また、capillary blotでは、この大きさでも問題なく転写されるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3834-2 - 2011/01/17 (月) 16:32:04 - AP どうしてもsemidry electroblottingじゃなきゃいけないんでしょうか。vacuumや電気などでトランスファすると流速が早すぎて、特に低分子量の核酸がメンブレンをすり抜けることがあります。 明確な理由がなければcapillary blotをおすすめします。特別な装置は必要ありませんし、それほど時間はかかりません。 濡らした濾紙を2,3枚重ねた上に、メンブレン、その上にあらかじめトランスファバッファに置換したゲルを乗せ、 これをペーパータオルのスタックの上に乗せるだけで良いです。長時間トランスファするときは、ゲルの上にトランスファバッファーを垂らすか、トランスファバッファを入れたリザーバからゲルの上に濾紙を渡して毛細管現象で供給できるようにします。 補足されづらく吸着力の弱い低分子RNAなので、メンブレンはポジティブチャージナイロンで厚口のものがよいと思います（Pall Biodyne-plus, Roche ポジティブチャージナイロンなど）。この点でノンチャージのHybond-NXは、ブロットの方法がなんであれ、不適当だと思います。 また、塩濃度低めのトランスファバッファだとキャピラリーブロットでも低分子量RNAは通り抜けることがあります。20x SSC（10xや2xだと成績が落ちる）のような塩濃度の濃いトランスファバッファを使いましょう。 ハイブリなど、ブロットをさらに外液に晒すような処理をする場合は、ブロット後の固定も重要です。共有結合性の結合を生じる、UV-crosslinkが簡単、確実です。

miRNAをsemi-dryでメンブレンへ転写したい 削除/引用 No.3834-1 - 2011/01/17 (月) 14:43:00 - mi miRNA をsemi-dry法でHybond-NXへ転写しようとしているのですが、 シグナルがうまく検出出来ません。 300mAで1時間転写して、RIで標識したDNAプローブで検出しています。 20nt付近のマーカーや100nt付近の内在コントロールなどはちゃんと転写、検出出来ているのですが、非常に少ない内在のmiRNAを検出しようとしているためか、シグナルが非常に弱いです。 しかもラボにあった年代物のHybond-N+へ試しに転写してみたら、NXより強い（でもかなり薄い）シグナルが検出出来ました。 条件は全く一緒でやったので、転写が最適化されていないんじゃないかと思ってるんですが、どなたか、small RNAのsemi-dryでの転写の最適化法をご存知の方がいたら教えて下さい。

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