全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.3831-10 - 2011/01/20 (木) 01:23:11 - tani caspase3 は cleaved caspase 3 でしょうか？

皆様有難うございます。 削除/引用 No.3831-9 - 2011/01/18 (火) 12:18:39 - あじさわ 皆様有難うございます。 クエン酸バッファーを使って沸騰後も１０分以上処理したほうがいいのですね。バッファーが枯れないように注意して試してみます。 切片は剥がれにくいと思うので、オートクレーブにもかけてみたいと思います。 TUNELも行ったことはあるのですが、TANELのキット自体がパラフィンよりも凍結の方が染まりやすいものであったようで、上手くいきませんでした。今用いているのは活性型caspase3抗体です。 凍結切片でも試したのですが、凍結切片の作製自体がうまくいかず…。 アポトーシスが起こることについては多くの報告がある実験系であり、アポトーシスが起こった後に起こる現象は確認が取れているので確実であると思っています。 皆様のおかげで今後の方針が決まりました。 また、御指導よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3831-7 - 2011/01/18 (火) 08:48:30 - 組織 陽性対照は染まってますか？ まずは、テクニカルな問題をクリアする必要があると思います。 マイクロウェーブは、95℃前後で、一定時間処理する必要があります。 沸騰直前で切ってしまうと、抗原賦活効果が弱いかもしれません。 一般的には、沸騰してから、さらに10〜20分加熱します。 私の経験では、20〜30分加熱が一番安定した結果が得られています。 （10〜15分だと、抗原によって結果が安定しないことがあった） 一度沸騰すれば、レンジのパワーを一番弱くして、時々突沸するくらいに調節します。 これで反応液の減少を抑えられると思います。 その後は、室温でゆっくりと冷まします。 反応液は、caspaseだとクエン酸緩衝液がいいでしょう。 ちなみにcaspaseはTUNELに比べて陽性細胞が少ないことが多いです。 他の方からも指摘がありますが、TUNELをやってみるといいかも知れません。

熱処理は 削除/引用 No.3831-6 - 2011/01/18 (火) 05:56:00 - KK 私はオートクレーブにかけています。 １０５℃、５分〜１２０℃、１０分ぐらいの間で。切片のできによって、耐えられるのなら強めの条件でやってます。 ところで、本当にアポトーシスは起こっているのでしょうか？ TUNELなどはされましたか？

(無題) 削除/引用 No.3831-5 - 2011/01/17 (月) 20:51:29 - royal free 脳ではありませんが、肝臓のパラフィン標本で染色していました。 ほかの方がご指摘のように、クエン酸での賦活化が一般的なようだと思います。マイクロウェーブで 約20分間処理していました。約15分くらい沸騰状態です。1時間くらい放置して、ゆるやかに冷まします。活性型caspase3でしょうか。いくつかの抗体を試しましたが、CS社のものが一番きれいに染まったように記憶しています。２次抗体はポリマーのような、感度が強いものがオススメです。

(無題) 削除/引用 No.3831-4 - 2011/01/17 (月) 20:08:35 - Boston-Pullman 沸騰してから10分間と習い、今でもそうしています。クエン酸バッファーをからさない様に注意が必要です。この賦活化のステップはかなり重要です。 最初のキシレン処理でパラフィンを完全に除去し、エタノールに完璧に置換するステップも重要です。

(無題) 削除/引用 No.3831-3 - 2011/01/17 (月) 15:51:29 - あじさわ KK様 御回答有難うございます。 以前、クエン酸バッファーでも試みてみたのですが、良い結果がでませんでした。 マイクロウェーブにかける時間とか関係あるのでしょうか。 私は沸騰する直前でやめているのですが。 よろしければ時間など教えて頂けると幸いです。

TEではなく 削除/引用 No.3831-2 - 2011/01/17 (月) 15:39:51 - KK クエン酸バッファーで加熱処理してみてはいかがでしょう？ 私はそれで染まりましたが・・・

caspase3抗体を用いた免疫染色(パラフィン切片) 削除/引用 No.3831-1 - 2011/01/17 (月) 11:40:08 - あじさわ マウスの脳のパラフィン切片を用いてDAB染色を行っています。 他の抗体(5種類くらい)では上手く染色出来ているのですが、caspase3では全く染色像が確認できません。 TEバッファーに入れてマイクロウェーブでの免疫賦活もやってみましたが…全く染色されず、抗体が悪いのでしょうか。 カスパーゼは染色されにくいという話も聞いたことがあるのですが、何か良い方法を知っている方がいれば、御教授よろしくお願いします。

全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---