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(無題) 削除/引用 No.3822-16 - 2011/01/17 (月) 16:42:38 - 学生 助言を下さったみなさまありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3822-15 - 2011/01/17 (月) 13:25:15 - 学生 >>おお　さん 　ホルムアミドはゲルの中に入れてはいましたが、サンプルのほうには 　ほんの少ししか（totalで１％とか）入れていませんでした。 　いろいろと基本的なところが不勉強すぎたようです。 　助言どうもありがとうございました。 　参考に実験を見直してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.3822-14 - 2011/01/15 (土) 17:54:40 - おお あ、フォルムあみどつかってなかったのかぁ。それは確かに原因かもしれない。不完全なアニーリングとか構造などの問題なら、バンドの位置や比率に再現性がないかもしれない。 あと気になるならウレアは9Mまであげれます。ゲルの温度はプレランで50度くらいまで持ち上げてやると、ゲル上での再アニーリングが構造上の移動度の変化を除外できるのでよくやられてますね。

(無題) 削除/引用 No.3822-13 - 2011/01/15 (土) 16:48:48 - おお >FITC付きプライマーは依頼して作ってもらったものですが、ついているのはひとつです。 いまはどうなのかわかりませんがFITCがクルードというか均一でないため一分子ついた状態でもダブレットになるというような記述を見たことがあります。高濃度のPAGEでプライマーを分離したときはシングルでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3822-12 - 2011/01/15 (土) 08:39:47 - 310 昔は変性ゲルで一本鎖にしたマイクロサテライトPCR産物の解析をしていましたが、ホルムアミドの比を忘れてしまいました。以下のWebからの引用です。 http://www.j-tokkyo.com/2003/C12N/JP2003-061677.shtml >ＰＣＲ産物を含有する１．５μＬの溶液を、２．５μＬの９９．５％のホル >ムアミド、０．５μＬのロード用緩衝液(50mg/mLのブルーデキストラン、>25mMのEDTA)および１．０μＬのジーン・スキャン(Gene Scan;登録商標）->500[ROX]サイズ・スタンダード(ABI-PRISM,PE Biosystems)の１．０μLと混 >合した。 GENESCANは完全に変性したDNAの長さをはかるシステムなので、上記の条件で変性すれば、大抵の場合は1本鎖のDNA解析ができると思います。検出器が何か分からないので、蛍光サイズスタンダードが使えるかどうか分かりませんが。このサイズスタンダードは上記条件下で確実に1本鎖になるので、DNAの長さはそこそこ正確に計れます。

(無題) 削除/引用 No.3822-11 - 2011/01/14 (金) 22:52:25 - 金田 さんをつけろよデコ助野郎

(無題) 削除/引用 No.3822-10 - 2011/01/14 (金) 17:10:18 - AP そのサンプルDNAは ・かなり大量のコピー数があり ・それ以外の、干渉しうるDNA配列を含まない ・鎖長が短い ので、理論的に変性後のアニールはかなり速い速度で起こります。ボイルした状態で完全に変性していたとしても、その後の処理中に部分的にアニールが起こっていても不思議ではないです。 水素結合を弱めるformamideは（おおざっぱに、1% fromamideにつき0.7℃、Tmが下がると言われている）、加熱したときに変性しやすくするだけでなく、ambient temperatureでアニールが起こるのを防ぐと期待できます。 >確認したいバンドが100bpと小さいのですが、DNAマーカーを同様に 　formamideを混ぜで変性させて大丈夫でしょうか。 大丈夫です（大丈夫じゃないかもと考える、根拠は何？）

(無題) 削除/引用 No.3822-9 - 2011/01/14 (金) 16:34:35 - 学生 ＞＞AP 　　 ＞DNAシークエンシングのサンプルですら、100% formamideに溶解した上で 　ボイルするくらいですから、その条件では十分に変性していないか変性状 　態を維持できていない可能性はあると思います。サンプルを一旦沈殿させ 　てformamideに溶かし直すか、サンプル溶液にformamideを可能な限り（終 　濃度50%以上はほしい）加えてみてはどうでしょうか 　＜返答＞ 　変性ゲルにformamideが20％となるように加えているのですが、 　サンプルにformamideを加えたほうがいいのでしょうか。 　一度やってみたいと思います。 ＞普通の二本鎖のDNAマーカを同様にして変性して使えばいいです 　確認したいバンドが100bpと小さいのですが、DNAマーカーを同様に 　formamideを混ぜで変性させて大丈夫でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3822-8 - 2011/01/14 (金) 16:23:27 - 学生 ＞＞と 　勘ですが、dsDNAは残っているだろうなぁ、という気はします 　その2種類のバンドは量的にはどれぐらいの差がありますか？ 　＜返答＞ 　蛍光で確認しているのですが、2本のうち下のバンドの蛍光が強いで 　す。肉眼確認でフェノールブルーあたりにでるものです。 　s1ヌクレアーゼを使用して何を見たらいいのでしょう？ 　 ＞＞＞おお 　FITC付きプライマーは依頼して作ってもらったものですが、ついているの 　はひとつです。 　可能性で高いのはプライマーダイマーか使用されなかったプライマーが 　蛍光を発しているのかもしれません。 　プライマーのみで泳動して確認する予定です。

(無題) 削除/引用 No.3822-6 - 2011/01/14 (金) 16:20:38 - AP >95度で加熱し、すぐに氷冷してssDNA(96塩基)（自分ではそう思うのです　 　が）を DNAシークエンシングのサンプルですら、100% formamideに溶解した上でボイルするくらいですから、その条件では十分に変性していないか変性状態を維持できていない可能性はあると思います。サンプルを一旦沈殿させてformamideに溶かし直すか、サンプル溶液にformamideを可能な限り（終濃度50%以上はほしい）加えてみてはどうでしょうか。 >ssDNAのサイズ確認のためにladderマーカー 普通の二本鎖のDNAマーカを同様にして変性して使えばいいです（今のようにコマーシャルで手軽にRNAラダーが手に入らなかった時代には、Northernのマーカーでも二本鎖DNAマーカーを変性して使っていたものです）。 ただし、DNAにニックが生じている場合、未変性で使う分には問題ないですが、一本鎖に変性するとランダムな小断片となってマーカーとして役に立たなくなります。新鮮なもの、保存状態のよいものを使いましょう。

(無題) 削除/引用 No.3822-5 - 2011/01/14 (金) 15:51:08 - おお FITCはバリエーションがあってそれで移動度の違うバンドが生じダブレットになることがあるようです。プライマー末端に一つだけの場合は蛍光色素にバリエーションがなければまず大丈夫ですが、色素の数で移動度が変わります。 PCRの条件により起こるトラブルも可能性は否定できません。

(無題) 削除/引用 No.3822-4 - 2011/01/14 (金) 15:27:28 - と s1ヌクレアーゼを使ってみれば他にも色々分かるかもしれません･･･

(無題) 削除/引用 No.3822-3 - 2011/01/14 (金) 15:25:02 - と 勘ですが、dsDNAは残っているだろうなぁ、という気はします その2種類のバンドは量的にはどれぐらいの差がありますか？

(無題) 削除/引用 No.3822-2 - 2011/01/14 (金) 14:31:32 - 中年 ご質問に対する答えではありませんが、熱変性しないものを隣のレーンに流して同じ泳動度かどうかを比べれば、dsDNAかどうかにはケリが付くのではありませんか。 また、市販のdsDNAマーカーを同様に変性すれば、ssDNAのマーカーとして使えると思います。分子量が小さいものは２本の鎖で泳動度がずれることもあるかもしれませんが。

変性ポリアクリルアミドゲルでの泳動度 削除/引用 No.3822-1 - 2011/01/14 (金) 14:20:38 - 学生 　同じような問題を別のトピックで見かけたのですが、問題が解決されてい　ないようなので再度質問させてもらってもいいでしょうか。 　 　テンプレートを用いて、蛍光つきプライマーでPCRしたdsDNAを 　95度で加熱し、すぐに氷冷してssDNA(96塩基)（自分ではそう思うのです　 　が）を７％尿素入りポリアクリルアミドゲルで泳動してバンドを確認して 　いるのですが、バンドが2本出てきます。　 　本来なら1本なのに2本出てくるのはなぜでしょうか？ 　 　PCR条件が悪くてプライマーダイマーができているのか、 　プライマーが過量すぎて見えるのか、他のトピックの人が書いていたよう 　にdsDNAの状態が残っているか 　さまざまなことが考えられますが、「dsDNAが残っている」という 　書き込みが気になります。 　また、基準となるladderを一緒に流したいのですが、ssRNA ladder 　というものしか発見できず、ssDNAのサイズ確認のためにladderマーカー 　(変性ポリアクリルアミド用)を使用してる場合どの会社のものか教えてい　ただきたいです。 　説明が雑すぎるかもしれませんが、ご指摘のほどよろしくお願いいたしま　す。

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