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Native-PAGEで分離ゲルに入っていかない トピック削除
No.3818-TOPIC - 2011/01/13 (木) 20:12:56 - KOH
いつも参考にさせてもらってます。
いま、タンパク質を融合タンパク質（分子量800,000)の形で発現精製し、Native-PAGEを行っていますが、濃縮ゲルは流れるものの分離ゲルに入っていきません。染色すると、分離ゲルの一番上にバンドが確認されています。

濃縮ゲルは2.5％で分離ゲルは５％アクリルアミド濃度です。
泳動は濃縮ゲルにサンプルが入るまでは３ｍA、以降は10ｍA、４℃で泳動しています。アドバイス等ぜひお聞かせ願います。
　
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No.3818-4 - 2011/01/14 (金) 13:14:56 - すがり
80Kの間違いでは？それともオリゴマーサイズが800KDa？もしそうならばNativePageはかなり無理があるんじゃないですかね。等電点がアルカリ側なのかもしれないですし。BlueNative Pageの方が可能性がありそうです。

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No.3818-3 - 2011/01/13 (木) 22:54:33 - w
IgMやIgMのdimerが、Invitrogenのマーカーとして出ていますが、使っていますか？
やや、高いので、単にIgMを750kDaのマーカーとして使う手はありかもしれません。
InvitrogenのHPや、MitoscienceのHPに取説があると思います。

(無題) 削除/引用
No.3818-2 - 2011/01/13 (木) 21:19:42 - うーん
800kDaですか。
どうでしょうそもそも分子量の問題なのか等電点の問題なのか…
等電点はその融合タンパク質の場合、どのように算出されておられますか？
web上でアミノ酸配列を元に算出できますが、糖鎖修飾があるとそれもあてになりませんが。

Native-PAGEで分離ゲルに入っていかない 削除/引用
No.3818-1 - 2011/01/13 (木) 20:12:56 - KOH
いつも参考にさせてもらってます。
いま、タンパク質を融合タンパク質（分子量800,000)の形で発現精製し、Native-PAGEを行っていますが、濃縮ゲルは流れるものの分離ゲルに入っていきません。染色すると、分離ゲルの一番上にバンドが確認されています。

濃縮ゲルは2.5％で分離ゲルは５％アクリルアミド濃度です。
泳動は濃縮ゲルにサンプルが入るまでは３ｍA、以降は10ｍA、４℃で泳動しています。アドバイス等ぜひお聞かせ願います。
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