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(無題) 削除/引用 No.3816-8 - 2011/01/15 (土) 09:36:20 - Actias なんだか分からないけどうまくいかないことはある。経験済み。 宿主は間違ってませんよね？ うちの部屋に昔からあったベクターは発現誘導かからなかったけど、それを作ったときのプロトコールと同じように作り直したら、うまくいったことがあります。 原因を追究していないので、何が改善されたか分かりませんが。 また、BL21(DE3) のラボストックを維持しているなら、継代するうちに誘導のかかりにくい菌に置き換わっていることがあるかも。 ぼくはそのことが気になったので、発現ベクターを導入して独立したコロニーを数十個拾い、それぞれ誘導をかけて、誘導効率のいい組換え体を、今度は抗生物質無しの寒天培地に広げ、プラスミドが落ちた菌を拾い直す、という操作をして、いい宿主を再クローニングしました。 今思うと、会社から買い直したほうが良かったのかも。

(無題) 削除/引用 No.3816-7 - 2011/01/14 (金) 09:43:21 - ばいや IPTGを添加していなくても出てくる場合もあるのでNCを変えたほうがいい。

ありがとうございます 削除/引用 No.3816-6 - 2011/01/13 (木) 19:24:39 - ちゃげ metkさん ベクターの設計はきちんと確認したのですが… レアコドンの関与については考えていなかったので、もう一度デザインから考え直してみます。 ご親切にありがとうございます。

補足 削除/引用 No.3816-5 - 2011/01/13 (木) 19:21:07 - ちゃげ 記述足らずですみません。 ウエスタンブロットでの検出の際はIPTG添加、無添加した両タンパク質を可溶画分・不溶画分に分けてSDS-PAGEに供していまして、反応はどちらとも可溶画分に強い反応を検出しました。 ですので、現段階では封入体は形成していないと思われます。 しかし、私の目的タンパク質は不溶性のものなので本来ならば不溶画分に反応が出るのが普通だとは思うのですが…

(無題) 削除/引用 No.3816-4 - 2011/01/13 (木) 19:15:42 - metk まず疑うべきはベクターのデザインを間違えたとか、レアコドンが関与してるんじゃ？ってとこだと思うんですが、そのあたりは確認済みでしょうか？ 聞いた限りではベクターを変えてもうまくいくようにならない気がします････

(無題) 削除/引用 No.3816-3 - 2011/01/13 (木) 19:09:12 - ちゃげ metkさん ご回答ありがとうございます。 ＞誘導がうまくいきません タンパクを誘導後、ウエスタンブロットで抗His抗体を用いて目的タンパク質が誘導されているか確認しました。 培養時にIPTGを添加したタンパクとネガコンとしてIPTGを添加しなかったタンパク質を泳動したのですが両方とも同じ位置に反応が出まして、どうやら内因性のHisに反応したみたいです。 IPTG添加区でネガコンと違う位置に反応が現れなかったのは目的タンパク質の発現量が極端に低いか誘導が行えていないかだと思うんですが。

(無題) 削除/引用 No.3816-2 - 2011/01/13 (木) 18:45:55 - metk ＞誘導がうまくいきません IBを形成したということでしょうか？発現量が少ないということでしょうか？ pBAD系は以前使いましたが、プロモーターが弱いなぁ････と感じました。 pBAD系で発現量がそれほど多くないのに、IBを形成した経験もあります。 結局、発現させたいタンパクによるんでしょうけど････

おススメのHis-tag付ベクター 削除/引用 No.3816-1 - 2011/01/13 (木) 18:38:57 - ちゃげ いつも勉強させていただいています。 私はpET-28bベクターを用いてHis-tag付リコンビナントタンパク質（大きさは約30kDa）を作製しています。 抗体作製のための抗原として使用する目的でタンパク質の誘導を行っているのですが、タンパク質の誘導がうまくいきません。 培養時間やIPTGの濃度も色々試してみたのですが改善されませんでした。 皆さんはHis-tag付のリコンビナントタンパク質を誘導される際にどのようなベクターをご使用になられていますでしょうか？ GSTやMBP-tagのように分子量の大きなtagがつかないベクターで、おススメのものがありましたらお教えいただけると幸いです。 あと、invitrogen社のpBAD/Hisキット、pBAD/Myc-Hisキットで組換えタンパク質を作製されている方がおられましたらタンパク誘導能等感想をお聞かせいただけないでしょうか？ よろしくお願いいたします。

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