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ありがとうございます。 削除/引用 No.3812-17 - 2011/01/16 (日) 16:54:03 - maro >みさん そうですね。その方法なら比較できるかもしれません。今後検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.3812-16 - 2011/01/15 (土) 22:41:25 - み トランスファー効率の問題を検討するためには、 タグ付きで発現させて精製し、Westernではない蛋白を可視化する方法（CBB染色など）でも検出して、Westernの結果と比較すれば良いのでは。

ありがとうございます。 削除/引用 No.3812-15 - 2011/01/15 (土) 21:01:20 - maro >おおさん そうです、ウェスタンでメンブレンへの転写効率です。きちんとお伝えできずすいません。 転写効率について、もしそういうことがあるとすれば査読とかで難癖を付ける人がいたら答えられないなぁと思いまして質問させていただきました。 確かに、おっしゃる方法が良さそうですね。検討させていただきます。 >ンンノさん >PVDF膜等への結合性の変化についての議論は聞いたことがありません。 そうですか。ありがとうございます。 ウェスタンで見たのは野生型と6アミノ酸挿入なのですが、6アミノ酸挿入は野生型の5倍か10倍はシグナルが強いです。 一応、転写効率はあまり変わらないという方向で考え、6アミノ酸挿入は何らかの別な要因でシグナルが強くなった、まずはその別な要因から探ることにします。

(無題) 削除/引用 No.3812-14 - 2011/01/15 (土) 20:27:36 - ンンノ 最初の質問についてですが、ウェスタンで観察されたシグナル強度の違いは 何倍くらいあるのでしょうか。 PVDF膜等への結合性の変化についての議論は聞いたことがありません。 影響はゼロではないでしょうけども、何倍も代わるとは考えにくいと思います。 親水性のタンパクであっても、変成させることで内部の疎水性残基が出てくる事で 結合させられると考えられています。 １０％以下のアミノ酸組成の変化で、結合性が劇的に変わるものではないでしょう。 どうしてもそこを議論しなければならないようなら、別の方法で発現定量系を くむしかないでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.3812-13 - 2011/01/15 (土) 20:21:02 - おお >[Re:12] maroさんは書きました : > 最初の質問に戻って申し訳ないですが、自分のサンプルは0.1%SDSで可溶化することが出来ているとして、疎水性アミノ酸を導入するとメンブレンへの転写効率が上がる、ということは考えられうるでしょうか？ ようするに0.1%のsdsで超遠心のペレットを溶解したということでしょうか。 なぜ0.1%のこだわっているんでしょうか。溶解後再構成とかお考えなんでしょうか。 それはともかく、0.1%ではよくわかりません。蛋白や含まれている脂質との比、処理方法でとけもするし、大半が解け残ることもあると思います。 プロとコールをぜんぶ把握してないので何ともいえない部分がおおいですが、もし収量を把握したいのであれば完全に解かして一度調べるべきです。 いま気がついたのですが、膜への転写効率というのはウエスタンの話ですか? 細胞の膜ではないんですね。それで誤解が生じてたんでしょうか? ウエスタンなら、そんな大きな違いは出ないと思いますがそれは感覚だけの話です。300弱のアミノ酸もある蛋白で十数塩基のアミノ酸でそんなに極端にかわるなら方法論として非常に難しい方法になりますよね。もちろん条件の設定があまりよくない状態ならばありえますが。 ようは最後まで想像で結論が出ないと思いますので、もしそこをクリアーにしたいのなら精製して同量の蛋白を流せばウエスタンの膜への転写効率は、あなたの実験の系で察しがつくと思いますがいかがでしょうか。 ただクルードナものでやったときにどこまで反映されるか見極めないといけないですが。

ありがとうございます。 削除/引用 No.3812-12 - 2011/01/15 (土) 19:53:26 - maro >metkさん >おおさん 最初の質問に戻って申し訳ないですが、自分のサンプルは0.1%SDSで可溶化することが出来ているとして、疎水性アミノ酸を導入するとメンブレンへの転写効率が上がる、ということは考えられうるでしょうか？ しつこくてすいません。。。

(無題) 削除/引用 No.3812-11 - 2011/01/15 (土) 16:20:58 - おお SDS sample buffer で溶解後、解けてないものとして多糖とかちんでんしていると、区別がつきませんね。 たとえば大腸菌でリコンビナントを作ったとき、大腸菌を直接SDSsample bufferで溶解したのと、マイルドな条件で可溶フラクションを調整したのをサンプルバッファーで溶解したのをSDSPAGE(0.1%SDS)でながすと、どこくらいがインクルージョンボディーにいったのかわかります。

(無題) 削除/引用 No.3812-10 - 2011/01/14 (金) 20:28:00 - metk n×sdsと混ぜて熱処理した後、遠心してみてください 沈殿がなきゃ溶けてます

ありがとうございます。 削除/引用 No.3812-9 - 2011/01/14 (金) 17:53:08 - maro >へリックス構造をとるように設計してますか? 挿入しているアミノ酸はPhe, Ile, Lue, Ala, Metなどです。Proは挿入してはいないです。 >超遠心の前に遠心はしてますよね、不溶性のものをのぞくために。 17,000gで遠心しています。 >インクルージョンボディーはsdsをつかえばほぼどんな蛋白でも可溶化できると思います。 そうなんですか。ありがとうございます。 0.1%SDSのbuffer,gelのSDS-PAGEだとインクルージョンボディは溶けますか？

(無題) 削除/引用 No.3812-8 - 2011/01/14 (金) 17:17:51 - おお あ、しつれい。膜フラクションを超遠心でわけているなら細かい不溶かくぶんが一緒に落ちてきている可能性はあるのかなぁ。。。 超遠心の前に遠心はしてますよね、不溶性のものをのぞくために。 インクルージョンボディーはsdsをつかえばほぼどんな蛋白でも可溶化できると思います。

(無題) 削除/引用 No.3812-7 - 2011/01/14 (金) 17:11:47 - おお 長くなった変異型がインクルージョンボディーにいって、かえってその方が安定なのでトータールのライセートでみたばあい変異型の発現りょうが増えたようにみえるということをいいたかったのですが、膜フラクションをとってきて発現量を見ているのであれば、話が違いますね。 膜貫通ドメインをそんなに長くして機能するんでしょうかね。へリックス構造をとるように設計してますか?

インクルージョンボディ。。。 削除/引用 No.3812-6 - 2011/01/14 (金) 16:55:56 - maro 膜貫通領域がむしろ短い野生型がインクルージョンボディを作って、膜貫通領域が長くなった変異型が作らない、というのは逆な気がしますが、確かにその可能性はあるかもしれません？ いま導入している“野生型”は異なる種（属の下）のものなので膜貫通領域が短すぎて導入株にはマッチしない？ ただ、細胞破砕液とそれを超遠心して膜画分とに分けるとバンドの強さは同じくらいなのです。インクルージョンボディを作ると破砕液のほうがバンドが濃いような気がしますが、いや、SDS-PAGEでちゃんと流れない？インクルージョンボディを作るとすぐ分解される？そのあたりの感覚が分からないので教えていただきたいものですが(^^;

(無題) 削除/引用 No.3812-5 - 2011/01/14 (金) 15:54:50 - おお 細胞内でインクルージョンボディーを形成したというオチはないですか?

すいません、もう一点 削除/引用 No.3812-4 - 2011/01/13 (木) 19:15:12 - maro 全部で208アミノ酸（野生型）です。

ご回答ありがとうございます 削除/引用 No.3812-3 - 2011/01/13 (木) 19:14:04 - maro 1〜12アミノ酸です。

(無題) 削除/引用 No.3812-2 - 2011/01/13 (木) 18:24:19 - metk 疎水性アミノ酸を何塩基挿入してるんですか？ 全部で何残基のタンパクですか？

一回膜貫通タンパク質の転写効率について 削除/引用 No.3812-1 - 2011/01/13 (木) 15:24:40 - maro バクテリアの一回膜貫通タンパク質をウェスタンで解析しています。 膜貫通領域の機能を調べるため、膜貫通領域に疎水性アミノ酸を挿入した変異を構築し、発現量をウェスタンで調べることとしましたが、疎水性アミノ酸を挿入した方が検出されるシグナルが強かったです。 この結果は、�@野生型よりもプロテアーゼなどの分解を受けにくくなった、�A単に変異型のほうが疎水性度が増えメンブレンへの転写効率が上がっただけ、この2つを想像していますが、実際、�Aの可能性はあるのでしょうか？ どなたかご経験のある方のご返事お待ちしております。

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