全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.3810-7 - 2011/01/15 (土) 03:33:06 - ab > この膜タンパク質に対するモノクロの特異性の確認のために、フローサイトをすることが必要なのです。 ふと思ったのですが、モノクロの特異性の確認になぜフローサイトが必要なのでしょうか。 Western blottingで非特異的なバンドがなければ特異性があると言えるし、抗Myc抗体で免疫沈降した後でも検出できれば、特異的だと言えると思います（変性状態を認識できる抗体なら）。 実は、既にこのモノクロを用いてフローサイトを行ってみて、染色できなかったとかそういうことでしょうか？ その場合、細胞膜透過処理の有無で染色に違いがあるなど顕微鏡下で確認しましたか？

(無題) 削除/引用 No.3810-6 - 2011/01/14 (金) 16:40:52 - yoshihiro 皆様アドバイスありがとうございます。 この膜タンパク質がマウスにおいて既にN末端が細胞外ドメインであることがわかっています。私は違う動物種でほぼ同じ実験をしております。アミノ酸配列から考えると同様の構造が予想されますので、N末端が細胞外であると予想しております。 プラスミドは作り代えずに細胞膜のビオチン化の方法で試してみたいと思います。 皆様ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3810-5 - 2011/01/14 (金) 16:03:41 - おお とポロジーは、膜貫通へリックス近傍のアミノ酸の電荷でそこそこの精度で予測できます。 膜にあるかどうかを確認しないといけないのに、チョット実験が飛躍しすぎているようなきがしますが、、、

(無題) 削除/引用 No.3810-4 - 2011/01/13 (木) 05:06:30 - ab 膜透過性がないビオチン化試薬で細胞膜表面のタンパク質を標識し、抗Myc抗体（or ストレプトアビジン）で免疫沈降後、SDS-PAGE、ブロッティングして、ストレプトアビジン-HRP（or 抗Myc抗体）で検出できれば細胞表面にあるタンパク質かどうかわかります。 免疫沈降はMycとストレプトアビジンを入れ替えても同じ結果が得られる事をしめした方がよいです。 抗体のノンスペがほとんどない事が前提ですが、あらたにベクター作成やシグナルペプチドの心配はいりません。

(無題) 削除/引用 No.3810-3 - 2011/01/13 (木) 04:30:12 - Boston-Pullman > 1回貫通型らしい膜タンパク質 N末端が細胞外ドメインであることはどのようにして証明されましたか？

(無題) 削除/引用 No.3810-2 - 2011/01/12 (水) 22:24:50 - Ｔ > 予想されるシグナルペプチドのすぐ下流にFlagの配列を挿入するのでしょうか？ そうです。

膜タンパク質のN末端にタグを付加するには。。。 削除/引用 No.3810-1 - 2011/01/12 (水) 20:38:02 - yoshihiro タンパク質発現の初心者です。 現在、1回貫通型らしい膜タンパク質をCHO細胞膜上に発現させようとトライしております。 今使用している発現ベクターはc末にmycがついており、ウエスタンで発現を確認していますが、細胞膜上に存在するかはわかりません。 細胞膜上に発現していることをフローサイトなどで確認するために、N末にFlagを付加することもこのベクターは可能なのですが、この場合、タンパク質が細胞膜上に輸送される段階で、シグナルペプチドが切断され、それより上流のFlagは発現しないのではないかと悩んでおります。予想されるシグナルペプチドのすぐ下流にFlagの配列を挿入するのでしょうか？ この膜タンパク質に対するモノクロの特異性の確認のために、フローサイトをすることが必要なのです。 哺乳類細胞での膜タンパク質の発現にお詳しい方、アドバイスお願い致します。

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---