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細胞膨張 削除/引用 No.381-9 - 2009/04/24 (金) 11:02:46 - ベルベ 半年ほど抱えている問題でありますので 多くの方に、アドバイスを頂き とてもうれしく感じます。 ありがとうございます。 私が使っている試薬は 一般的に用いられているものであり 細胞毒性などの報告においても 私が用いている5，25uMにおいては、そのような報告はされておりません。 スライス培養法でありますので、培養細胞における細胞毒性と正確に等しいとは言えませんが・・・ これまでの報告では、細胞保護作用を示しており 私もそれを期待し、また先輩もそれを論文にしていますので 私の現在の結果は、喜べるものではありません・・・。 また安定性については、まだ検討しておりませんでした。 大本の保存は粉末でありますが、 はじめにDMSOに25ｍMの一次ストックを作成し、 使う毎に希釈しております。 私の使用している試薬は、塩には弱いようで salineなどへの溶解性はとても低くなってしまいます。 そのため、はじめに考えられたのが 25ｍM ストックから、培地へ段階希釈する際に 塩を形成しているのではないか？と思い 培地への希釈に段階希釈ではなく、 一気に1000倍希釈を行いました。 しかし、それでも結果は同じでありました。 しかし、まず　アドバイスを頂いたように 試薬を購入しなおしてみようと思います。 まだまだ初心者ですので、 先輩方からのアドバイスはとても参考になります。 ありがとうございました。

試薬の安定性は？ 削除/引用 No.381-8 - 2009/04/24 (金) 02:59:13 - Tb その試薬はどれくらい安定なものか情報はありますか？ 遮光保存が必要とか、減圧あるいは窒素充填バイアルできたとか。 保存はDMSOに溶解したものを一次ストックとしているのか、それとも粉末で持っているのか。 買えるもののようですし、新品に換えてみては？

(無題) 削除/引用 No.381-7 - 2009/04/23 (木) 17:48:15 - おお その先輩が間違えていて貴方が正しいということはあり得ますけど、 あなたの結果は場合によっては期待できる結果なのでしょうか? 自身が持てる程度に、各種チェック、再現性をみて結論をだせば いいのではないでしょうか。

細胞膨張 削除/引用 No.381-6 - 2009/04/23 (木) 16:48:46 - ベルベ 追記 培地は細胞にかけているといいますか、 私が行っている培養法では 界面培養法を用いておりますので、 正確には、 フィルターの下に培地を加え、フィルター上部にはスライスがあるのみで 培地はありません。

細胞膨張 削除/引用 No.381-5 - 2009/04/23 (木) 16:46:47 - ベルベ お答えありがとうございます。 あらかじめ培地に混ぜてから組織にかけています。 また試薬については先輩が購入された試薬をそのまま使っていますので 間違っている事はないことを確認しました。 また濃度についても確認しましたが、 間違いはありませんでした。 貴重なアドバイスありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.381-4 - 2009/04/23 (木) 16:26:40 - ~ あらかじめ培地に混ぜてから組織にかけているのでしたら、 ハンドリングの影響はあまりないと思いますけど。 DMSO単独で起きない以上は、試薬の質か濃度が一番怪しいと思いますけど。 薬剤の濃度を1,000倍くらい間違えているとか… m(ミリ)とu（マイクロ）を見間違えたり、 /Lの濃度を/mLにしてしまったり というのはたまに見かけます。 水溶性ではないということですので、塩の形が違うということはないと思いますが、 試薬を間違えて、一段下のよく似た名前の試薬を発注していたり… ノートを置いていく方針のラボであれば、 先輩のノートをあさって作り方やロット番号などを確認して、 濃度や、Cat#とLot#が合うかどうかなどを確認してみてはいかがでしょうか。

細胞膨張 削除/引用 No.381-3 - 2009/04/23 (木) 16:01:20 - ベルベ お答えありがとうございます。 はい。 再現性はあります。 また、DMSOは最終濃度0.1%で行ってもみましたが 同じ結果となりました。 また、先に行っていただいた先輩は もう研究室にはおらず、連絡ができるのみであります。 はじめは浸透圧などを疑いましたが、 先に先輩が行ったときは、 そのような問題はまったくありませんでしたので、 私の操作に誤りがあるのだとはおもうのですが・・・・

(無題) 削除/引用 No.381-2 - 2009/04/23 (木) 15:46:44 - おお あなたの実験は再現性取れますか? 先輩の作った薬剤の溶液で貴方がやっても同じことが起こりますか? DMSO 1%がバイチでの最終濃度ならちょっと高いのではないでしょうか? せめて0.1%か、それ以下にした方がいいと思えますが、、、 培養の対象によると言われるとそうなのですが、、、

細胞膨張 削除/引用 No.381-1 - 2009/04/23 (木) 13:48:19 - ベルベ 現在、スライス培養法を行っており 培養は正確にできるようになりました。 そこで薬物投与を行う段階に入り、薬物は水溶性ではないので DMSOに薬物をあらかじめ溶解し、 DMSOの最終濃度が1％になるように培地で希釈したものを 薬物として、いつもの培地同様、スライスに添加します。 すると、薬物を添加したものだけ、 スライスが白っぽくなり、膨張している印象を受けました。 また見た目は、水々しいのですか 染色したところ、細胞死が観察されました。 しかし、同じ実験を、先に先輩が行ったところ 薬物添加だけでは、何も生じはしませんでした。 私の実験の仕方に何か問題があるようなのですが、検討つきません。 DMSOのみ添加では、何も生じません。 このような経験、また何か気をつける事が お分かりでしたら、教えてください。

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