wさま、ABZOさまご回答ありがとうございます。
wさま
＞１）どうやって、溶解していないことを確認しているのですか？
SDS-PAGEやwesternで確認している？
まず硫安沈殿を行う前に一度別のカラムを用いて租精製を行っているのですが、その後のサンプルは目視でも確認できるくらいピンク色を呈しております。そこに硫安を添加していくと赤色沈殿が生じます。遠心後上清を除くと、チューブの底に赤色沈殿がたまっており、これが目的のタンパク質のようです。これは沈殿をSDS-PAGEで確認した結果判断しました。またこれをいくら懸濁しても溶液中を沈殿の塊が浮遊するばかりという感じです。
＞２）沈殿に、沈殿しない程度の硫安溶液か、1%程度のNaClを加えると、溶けますか、溶けませんか？
硫安溶液の方は試したことがないので、今度確認させていただきます。
懸濁に用いているバッファーには100mMのKClが含まれているのですが、
これでは足りないでしょうか？
＞３）最初の抽出液が、界面活性剤アリではないですよね？
界面活性剤アリでの硫安分画は、難易度が高いですよ。
界面活性剤は用いていません。他にも特別なものは用いていないと思います。
ABZOさま
＞沈殿を懸濁したあと,その懸濁液を望みのバッファーで透析して硫安濃度を十分に下げないとうまく溶けないよ。沈殿にも高濃度の硫安混じってるから。数時間、透析してるとそのうちだんだん透明度が増してくるから分かる。
上でも述べましたが、沈殿を再懸濁するときに赤色沈殿が溶液中を浮遊しております。これが細かい沈殿だったら良かったのですが、沈殿同士が集まり合って、割と大きな塊を形成しております。うちではシリンジを用いて透析の容器に溶液を入れているのですが、その時にその塊がシリンジの内部にくついたりしてしまい、ほとんどをそこでロスしてしまうということがありました。
これは沈殿の集め方が悪いのでしょうか？（今は硫安添加後に遠心して沈殿を集めています） |
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